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1、Real-time PCRReal-time PCR检测技检测技术原理和问题处理术原理和问题处理2014-06-25 2014-06-25 实时荧光定量PCR检测技术（Real-time PCR) 荧光定量PCR（Realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量实验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。实时荧光定量PCR检测技术（Real-time P
2、CR)l 定量定量PCRPCR的数学原理的数学原理l 定量PCR的化学原理l 定量PCR的光学原理什么是PCR？ PCR的反应过程RT-PCR原理图荧光定量PCR的数学原理1、Baseline (基线)2、Threshold (阈值)3、Threshold Cycle (CT值)4、DNA0 (初始模板)Threshold Threshold ( (阈值) )DNADNA0 0 ( (初始模板初始模板) )Threshold Cycle Threshold Cycle (CT(CT值) )Baseline Baseline 基基线基线 反应荧光明显增加前的背景荧光值。默认为3-15 cycle
3、s的信号值线性性图谱对数数图谱阈值 阈值= 基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即 PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近。 Ct值 扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与 Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。DNA0确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度l初始初始DNADNA量越多量越多, , 荧光达荧光达到某一值（域值）时所需到某一值（域值）时所需要的循环数越少要的循环数越少lLogLog浓度与循环数呈线性浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到关系，根据样品扩增达到
4、域值的循环数就可计算出域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量样品中所含的模板量 Real-time PCR动力学曲线和四个阶段 只有在荧光信号只有在荧光信号指指数扩增阶段数扩增阶段， PCR PCR 产产物量的对数值与起始模物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶我们可以选择在这个阶段进行定量分析。段进行定量分析。 PCRPCR理论方程只在理论方程只在指数期成立。指数期成立。PCR产物的量与扩增循环数间的理论方程R Rn n = R = RB B + X + X0 0 (1+ e) (1+ e)n n R Rs s R Rn n : :第第N N次
5、次PCRPCR循循环时的的荧光信光信号号强度强度R RB B : :背景信背景信号号强度强度X X0 0 (1+ e) (1+ e)n n R Rs s : :每每个个分子的分子的荧光强度光强度与与分子分子数数目的乘目的乘积 经过一系列移一系列移项、取、取对数数等等复复杂数学数学公式公式变换：得到：得到：Ct = k lg X0 0 + b 线性方程， lg X0 0 越大，则CT值越小！ 从荧光信号实现定量结果 一、检测荧光信号增长，获取样品CT值 从荧光信号实现定量结果 二、绘制标准曲线 从荧光信号实现定量结果 三、以待测样品的Ct值对DNA0作图，得到定量结果l 定量定量PCRPCR的数
6、学原理的数学原理l 定量PCR的化学原理l 定量PCR的光学原理常用的荧光标记方法1、DNADNA双链特异性染料 SYBR Green 、SYTO 9、LC Green、Evagreen2、序列特异性探针 TaqMan 、Molecular Beacons（分子信标）、Dual Probes (FRET)、LNA(Locked Nucleic Acid) Double-Dye probesSYBR Green I 工作原理1、每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2、染料一结合，就产生荧光信号3、信号强度与DNA分子总数目成正比SYBR Green ISYBR Green I工作原理
7、图片演示熔解曲线(Dissociation curve)目的：在PCR之后分析产物特异性基本程序： -解链； -复性； -升温检测； -降温；软件自动分析融解曲线(Dissociation curve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。TmTm值：50%DNA变成单链时所需要的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表产物序列的特异性；PCR反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBR Green被释放，荧光信号逐渐减弱；当体系到达某一特定温度时，某些DNA双链会突然完全解离，荧光强度也显著减弱；对融解曲线求一阶导数，峰值代表
8、斜率改变最大值，该处所对应的横坐标值（温度），即Tm融解曲线(Dissociation curve)PCRPCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。原始图谱原始图谱导数图谱导数图谱只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。SYBR Green ISYBR Green I的优缺点成本低 不需要制备序列特异的针对性探针，且试剂便宜适合初步筛查 先用SYBR筛查，再对少数关键样品用探针法确认配合熔解曲线分析 需鉴定PCR反应是否有杂带、引物二聚体特异性问题 不能分辨主带与杂带，给出所有双
9、链DNA的总信号多重定量问题 每个PCR管只能检测一个目标基因TaqmanTaqman原理原理 Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。 TaqMan探针的作用机理TaqmanTaqman探探针优点1.灵敏、特异性高：灵敏、特
10、异性高：每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，实时检测特异扩每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，实时检测特异扩增片断，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性增片断，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性2.有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测多重多重PCR，降低成本也提高效率和准确性，降低成本也提高效率和准确性3.避免了荧光染料对避免了荧光染料对PCR反应的影响反应的影响缺点 1.探针设计有一定难度，需要验证效果探针设计有一定难度，需要验证效果2.探针合成质量对试验结果有较大影
11、响探针合成质量对试验结果有较大影响3.荧光标记成本较高荧光标记成本较高多重检测原理原理 同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因 不同的探针识别不同的靶基因 不同的荧光报告基团标记不同的探针目的目的 提高效率，节省时间 降低研究成本特点特点 一次提取DNA/RNA、一次反应、定量多个基因 要保证信号之间互不干扰常用的荧光染料DyeDyeExcitation Maxima (nm)Excitation Maxima (nm)Emission Maxima (nm)Emission Maxima (nm)FAMFAM495495520520SGISGI497497522522TETTET52152
12、1540540VICVIC530530552552JOEJOE526526552552HEXHEX540540557557CY3CY3552552570570TAMRATAMRA552552578578ROXROX585585605605Texas RedTexas Red595595615615CY5CY5643643667667l 定量定量PCRPCR的数学原理的数学原理l 定量PCR的化学原理l 定量PCR的光学原理荧光PCR区别于其他PCR方法主要有以下优点1) 全封闭反应，无需PCR后处理 2) 特异性强，灵敏度高 3) 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确 4) 定量范围宽，可达
13、到10个数量级 5) 仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断 6) 可实现一管双检或多检7) 操作安全，缩短时间，提高效率 8) 利于自动化和联网管理 定量PCR常见问题处理扩增曲线-Amplification Plot-Amplification Plot 标准曲线-Standard Curve-Standard Curve 原始数据-Component-Component 各波长的原始信号-Spectra-Spectra 融解曲线-Dissociation-Dissociation 定量PCR实验中的10个常见缺陷1.引物或探针的设计不过关2.RNA模板质量差3.没有使用“预混液”，导
14、致差异的累积4.发生污染5.没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰6.选取了不恰当的“内参基因”7.在使用SYBR Green染料的实验中，没有引入“融解曲线分析”8.没有正确设置“基线”和“阈值线”9.反应体系“扩增效率”低下10.标准曲线的范围没有涵盖样品量的变化导致异常实验数据的常见原因错误的荧光染料设置错误的反应程序设置荧光污染反应试剂质量问题仪器硬件问题未正确密封而导致的试剂蒸发实例1：没有标准曲线标准品没有填写相应的数值标准品没有填写相应的数值实例2：没有扩增曲线原因1：PCR参数设置错误数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。数据收集步骤只有一个循环，只收集了
15、一个数据点。实例2：没有扩增曲线原因2：硬盘休眠，数据采集中断实例3：基线下滑从原始数据找原因1-91-9循环，循环，ROXROX的信号下降的信号下降基线设定基线设定4-4-1313范围内，范围内，ROXROX信号值变化，信号值变化，FAMFAM的信号值基本固定；的信号值基本固定；FAM/ROXFAM/ROX的校正的校正后，基线不是水平的直线；后，基线不是水平的直线；应该取应该取ROXROX信号稳定的信号稳定的10-2010-20循环为合理的基线范围。循环为合理的基线范围。实例3：基线下滑修改基线范围为10-20，重新分析实例3：基线下滑基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的图谱实例4：
16、扩增曲线弯曲 原因：基线设置的终点大于样品CT值。通常是因为模板DNA浓度过高，若CT值 15，而基线范围仍然取3-15其中基线荧光包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值设定过高。 解决方案：减小基线终点设置至最小CT值前4个循环，重新分析数据。实例4：扩增曲线弯曲原因：原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。解决方案：解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；浓度太高的样品，需稀释后另做实验。实例5-1：直线扩增曲线部分探针降解后，部分报告荧光基团从探针上脱落导致：基线抬高；扩增与荧光信号的增加不一致。实例5-
17、2：直线扩增曲线扩增曲线是一根水平直线扩增曲线是一根水平直线说明没有检测到信号，提示实验失败说明没有检测到信号，提示实验失败实例6：非特异性扩增SYBR Green I SYBR Green I 实验，Dissociation curveDissociation curve分析推荐措施：提高引物设计质量，避免形成引物二聚体补救措施：优化引物浓度和退火温度，专设高温度的收集信号步骤实例7：重复性不佳正常的原始数据实例7：重复性不佳不正常的原始数据原因：盖子未盖紧，溶液蒸发。原因：盖子未盖紧，溶液蒸发。疾病监测中常用的反应MixABI公司AgPath-IDOne Step RT-PCR Kit（货号货号AM1005）Invitrogen 公司SuperScriptIIIPlatinumOne-StepqRT-PCRKitw/ROX（货号（货号11745-100）QIAGEN公司公司QuantiTectProbeRT-PCRKit （货号204443） Thanks for your attention Thanks for your attention
