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1、实验四四 （一）球菌病原学的（一）球菌病原学的检测实验内容实验内容1 1 球菌形态观察球菌形态观察2 2 血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验3 3 抗抗“O O”试验试验实验目的实验目的 1 1 掌握葡萄球菌，链球菌，淋球菌形态特征掌握葡萄球菌，链球菌，淋球菌形态特征 2 2 熟悉血浆凝固酶实验的原理，方法及临床意义。熟悉血浆凝固酶实验的原理，方法及临床意义。 3 3 掌握抗掌握抗“O O”实验的原理，意义及方法。实验的原理，意义及方法。 4 4 触酶试验试验触酶试验试验球菌的球菌的检验程序程序标本标本直接检查直接检查（涂片、染色、镜检）（涂片、染色、镜检）分离培养分离培养可疑菌落可疑菌落菌落特点菌
2、落特点鉴定试验鉴定试验第第一一次次第第二二次次生化结果观察生化结果观察荚膜染色荚膜染色结果讨论与分析结果讨论与分析第三次形态、色素、溶血形态、色素、溶血血浆凝固酶、血浆凝固酶、触酶、菊糖发触酶、菊糖发酵、酵、甘露醇发酵、胆汁溶菌、甘露醇发酵、胆汁溶菌、小白鼠毒力试验小白鼠毒力试验常常见致病性球菌染色特点致病性球菌染色特点葡萄球菌链球菌双球菌 革兰阳性革兰阳性 革兰阳性革兰阳性 革兰阳性革兰阳性不规则成堆排列不规则成堆排列链状排列链状排列 矛头状成双排列矛头状成双排列脑膜炎奈瑟球菌脑膜炎奈瑟球菌 淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌 革革兰阴性球菌阴性球菌奈瑟菌染色特点：肾形或豆形，成双排列、奈瑟菌染色特点：肾
3、形或豆形，成双排列、凹面相对的革兰阴性球菌凹面相对的革兰阴性球菌菌落可出现金黄色、白菌落可出现金黄色、白 色色或柠檬色等色素或柠檬色等色素血平板上，金黄色葡萄球菌血平板上，金黄色葡萄球菌可形成可形成 - -溶血环溶血环表皮葡萄球菌呈白色菌落葡萄球菌在血平板上菌落葡萄球菌在血平板上菌落链球菌属（球菌属（Streptococcus） 链球菌在血平板有三种溶血现象 （1）甲型溶血（2）乙型溶血（3）丙型溶血132链球菌菌落形态链球菌菌落形态血平板：血平板：灰白色圆形凸起的细小菌落，不同菌株溶血不一。化脓性链球菌草绿色链球菌肺炎链球菌菌落1. 血浆凝固酶试验【原理】致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血
4、浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细胞表面生成凝块。【操作】取生理盐水各1滴分别滴于载玻片上，用接种环挑取细菌，混合后观察有无自凝现象。取1滴兔血浆混匀分别滴于载玻片上,观察有凝固现象（3-5s）。【结果】金黄色葡萄球菌为阳性，表皮葡萄球菌为阴性【意义】血浆凝固酶试验可区分致血浆凝固酶试验可区分致血浆凝固酶试验可区分致血浆凝固酶试验可区分致病性和非致病性葡萄球菌病性和非致病性葡萄球菌病性和非致病性葡萄球菌病性和非致病性葡萄球菌生化反应鉴定生化反应鉴定示教示教示教示教2.触酶试验【原理】 H2O2 H2O + O2【操作】取洁净玻片一张，取生理盐水各1滴分别滴于载玻片上，以接种环分别取待检细
5、菌培养物少许，滴加3 H202一滴（立刻），在H202中磨匀，立即观察结果。【结果】阳性为半分种内产生大量气泡。葡萄球菌为阳性，链球菌为阴性。【意义】 触酶试验可区分葡萄球菌和链球菌。生化反应鉴定生化反应鉴定过氧化氢酶过氧化氢酶示教示教示教示教3. 甘露醇发酵试验【原理】致病性葡萄球菌多含有分解甘露醇的酶类，能发酵甘露醇产酸，培养基由紫色变为黄色。【操作】细菌分别接种甘露醇单糖发酵管，经37孵育18-24h观察结果。【结果】金黄色葡萄球菌为阳性，表皮葡萄球菌为阴性血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验可区分致病性血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验可区分致病性血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验可区分致病性血浆凝
6、固酶试验和甘露醇发酵试验可区分致病性和非致病性葡萄球菌和非致病性葡萄球菌和非致病性葡萄球菌和非致病性葡萄球菌生化反应鉴定生化反应鉴定4.菊糖发酵试验【原理】大多数肺炎链球菌可以分解菊糖，菊糖发酵产酸，指示剂呈酸性反应，发酵管由黄色变为紫红色。【操作】细菌分别接种菊糖发酵管，经37孵育18-24h观察结果。【结果】用以区分肺炎链球菌和甲型链球菌，肺炎链球菌为阳性，甲型链球菌为阴性。生化反应鉴定生化反应鉴定5.胆汁溶菌试验【原理】肺炎链球菌可产生一种自溶酶，胆盐能活化自溶酶，加速自溶过程，引起细胞自溶。【操作】胆汁溶菌试验可用以区分甲型链球菌和胆汁溶菌试验可用以区分甲型链球菌和胆汁溶菌试验可用以区
7、分甲型链球菌和胆汁溶菌试验可用以区分甲型链球菌和肺炎链球菌肺炎链球菌肺炎链球菌肺炎链球菌生化反应鉴定生化反应鉴定37，24 h+ 胆盐（胆盐（0.1 ml）37，0.5 h【结果结果】液体由混浊变透明为阳性，肺炎链球菌为阳性，液体由混浊变透明为阳性，肺炎链球菌为阳性，甲型链球菌为阴性。甲型链球菌为阴性。【意义意义】接种细菌接种细菌生化反应鉴定生化反应鉴定6.抗链球菌溶血素“O”（ASO）试验（快速胶乳法）（快速胶乳法）【原理】本试剂胶乳液是由溶血素O和羟化聚苯乙烯胶乳共价交联而成的抗原胶乳。ASO胶乳的灵敏度调整到200IU/ml，超过上述滴度即出现肉眼可见凝集颗粒，产生清晰凝集，为阳性；无凝
8、集，为阴性。【操作】试剂预温至室温，并轻轻摇匀。 在反应板各格子上分别滴加1滴(约50l)阴性、阳性和待测血清，再各滴加ASO胶乳试剂1滴，轻轻摇匀，2min后观察结果。【结果结果】有清晰凝聚者为阳性（ASO200 IU/ml） 不出现凝聚者为阴性（ASO200 IU/ml）【意义意义】1.1.抗体滴度抗体滴度 200IU/ml200IU/ml以上，以上，新近有可能反复感染过乙型溶新近有可能反复感染过乙型溶新近有可能反复感染过乙型溶新近有可能反复感染过乙型溶血型链球菌血型链球菌血型链球菌血型链球菌 2.2.作为作为风湿活动期、风湿性关节炎、风心病、急性肾小风湿活动期、风湿性关节炎、风心病、急性
9、肾小风湿活动期、风湿性关节炎、风心病、急性肾小风湿活动期、风湿性关节炎、风心病、急性肾小球肾炎、的辅助诊断球肾炎、的辅助诊断球肾炎、的辅助诊断球肾炎、的辅助诊断。示教示教示教示教【注意事项】q无菌操作q挑取细菌培养平板上的单个菌落进行生化鉴定。生化反应鉴定生化反应鉴定致病性球菌的主要生物学性状致病性球菌的主要生物学性状鉴别要点鉴别要点革兰染色革兰染色触酶触酶金黄色金黄色葡萄球菌葡萄球菌表面表面葡萄球菌葡萄球菌乙型乙型链球菌链球菌甲型甲型链球菌链球菌肺炎肺炎链球菌链球菌血浆凝固酶血浆凝固酶胆汁溶菌试验胆汁溶菌试验G+G+，球型，球型葡萄状排列葡萄状排列G+ G+ ，球型，球型葡萄状排列葡萄状排列
10、G+ ,G+ ,球型球型长链状排列长链状排列G+ ,G+ ,球型球型短链状排列短链状排列G+ ,G+ ,球形球形成双成双, ,矛头相对矛头相对溶血环溶血环无无无无溶血环溶血环 溶血溶血环环溶血环溶血环溶血环溶血环颜色颜色金黄金黄金黄金黄灰白色灰白色灰白色灰白色草绿草绿草绿草绿+ + + +溶血溶血菌落特征菌落特征生化反应生化反应白色白色白色白色+ + + + + + + + + +草绿草绿草绿草绿甘露醇发酵试验甘露醇发酵试验菊糖发酵试验菊糖发酵试验+ + + + + + +常见肠道杆菌在伊红美兰琼脂平板（常见肠道杆菌在伊红美兰琼脂平板（EMBEMB）及）及SSSS培培养基上的菌落特点养基上的菌
11、落特点 n1. 1. 大肠杆菌菌落：较大、圆形、光滑、不透明，大肠杆菌菌落：较大、圆形、光滑、不透明，在在EMBEMB上形成上形成深紫兰色菌落深紫兰色菌落（因分解乳糖产酸，（因分解乳糖产酸，与伊红美兰结合之故），在与伊红美兰结合之故），在SSSS琼脂平板上形成琼脂平板上形成红色菌落红色菌落( (因分解乳糖产酸，中性红指示剂变红因分解乳糖产酸，中性红指示剂变红) )。n2. 2. 伤寒杆菌和痢疾杆菌菌落：中等大、圆形、伤寒杆菌和痢疾杆菌菌落：中等大、圆形、光滑、半透明、在光滑、半透明、在EMBEMB上无色（因不分解乳糖），上无色（因不分解乳糖），在在SSSS上无色或淡黄色。上无色或淡黄色。实验四
12、实验四 （二）肠道杆菌的病原学的检测（二）肠道杆菌的病原学的检测乳糖发酵乳糖发酵试验试验原理：原理：肠道肠道杆菌能分解乳糖产酸，杆菌能分解乳糖产酸，指示剂溴甲酚紫指示剂溴甲酚紫(pH5(pH52 2为黄为黄色，色，pH6pH68 8为紫色为紫色) )，当发酵，当发酵产酸时，使培养基由紫色变为产酸时，使培养基由紫色变为黄色黄色结果：结果：致病菌致病菌多为阴性多为阴性， 非非致病菌多为阳性致病菌多为阳性。用途：用途：鉴别致病性与非致病性肠道杆菌鉴别致病性与非致病性肠道杆菌实验四实验四 （二）肠道杆菌的病原学的检测（二）肠道杆菌的病原学的检测 问题与讨论问题与讨论1.1.如何鉴别致病性葡萄球菌与非致病性葡萄如何鉴别致病性葡萄球菌与非致病性葡萄球菌？球菌？2.2.如何鉴别肺炎球菌与甲型链球菌？如何鉴别肺炎球菌与甲型链球菌？3.3.什么是抗什么是抗“O”试验，说明其临床意义？试验，说明其临床意义？4.4.怎样鉴别致病性与非致病性肠道杆菌？怎样鉴别致病性与非致病性肠道杆菌？本次实验课结束本次实验课结束交作业，值日同学留下交作业，值日同学留下下周再见！下周再见！
