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1、动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术/ /与疫与疫苗生产工艺优化苗生产工艺优化兰州生物制品研究所兰州生物制品研究所徐斌徐斌主要内容大规模细胞培养历史与展望大规模细胞培养历史与展望大规模细胞培养技术及应用大规模细胞培养技术及应用对生物反应器的要求对生物反应器的要求 大规模细胞培养历史与展望大规模细胞培养历史与展望 现现代代细细胞胞培培养养应应该该说说是是从从HarrisonHarrison和和CarrelCarrel两两人人开开始始的的， HarrisonHarrison于于19071907年年在在体体外外无无菌菌条条件件下下使使神神经经细细胞胞存存活活多多达达3030天天, ,标标志志
2、着着细细胞胞培培养养的的开开始始。1919世世纪纪4040年年代代，抗抗生生素素的的应应用用和和无无菌菌技技术术的的发发明明，使使得得细细胞胞培培养养取取得得重重大大进进展展。19551955年年EagleEagle研研制制成成功功EMEMEMEM培培养养基基、19621962年年CapstickCapstick悬悬浮浮培培养养BHKBHK细细胞胞以以及及永永久久性性细细胞胞系系的的建立成为动物细胞大规模培养的关键技术建立成为动物细胞大规模培养的关键技术 利利用用动动物物细细胞胞培培养养技技术术生生产产具具有有重重要要医医用用价价值值的的疫疫苗苗已已成成为为医医药药生生物物高高科科技技产产业业
3、的的重重要要部部分分，BHK21BHK21细细胞胞的的悬悬浮浮培培养养是是动动物物细细胞胞工工业业化化应应用用的的突突破破性性进进展展，其其连连同同传传代代细细胞胞系系的的建建立立，共共同同驱驱动动了了细细胞胞大大规规模模工工业业生生产产进进程程的的发发展展。19671967年年，Van Van WezelWezel开开发发了了微微载载体体并并进进而而实实现现了了贴贴壁壁细细胞胞在在生生物物反反应应器器中中的的大大规规模模培培养养 细细胞胞培培养养经经历历100多多年年的的发发展展，应应用用范范围围逐逐渐渐扩扩大大，培培养养方方式式不不断断更更新新，各各种种生生物物反反应应器器的的出出现现加加
4、强强了了人人们们对对大大规规模模细细胞胞培培养养的的研研究究，对对细细胞胞生生长长环环境境、细细胞胞代代谢谢、培培养养基基和和细细胞胞培培养养过过程程等等条条件件优优化化将将是是未未来来细细胞胞培培养养的的发发展展方方向向，推推动动细细胞胞培培养养在在疫苗生产领域的应用，更好的造福于人类疫苗生产领域的应用，更好的造福于人类 大规模细胞培养技术及应用大规模细胞培养技术及应用n动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养法和悬浮动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、流式细胞术、培养法基础上，再融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术
5、而发展填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载体培养、微囊化培起来的。主要包括悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中空纤维法等养、中空纤维法等n如今这一技术已广泛应用于现代生物制药的研究和生如今这一技术已广泛应用于现代生物制药的研究和生产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、治疗和诊产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、治疗和诊断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子、生物产品乃断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子、生物产品乃至人造组织等产品提供了强有力的工具至人造组织等产品提供了强有力的工具l所所谓谓动动物物细细胞胞大大规规模模培培养养技技术术是是指指在在人人工工条条
6、件件下下（设设定定phph、温温度度、溶溶氧氧等等），在在细细胞胞生生物物反反应应器器中中高高密密度度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术l目目前前大大规规模模培培养养的的动动物物细细胞胞有有多多种种原原代代细细胞胞及及人人二二倍倍体体细细胞胞、CHOCHO细细胞胞、BHK-21BHK-21、VeroVero细细胞胞等等传传代代细细胞胞，并并已已成成功功生生产产了了包包括括狂狂犬犬病病疫疫苗苗、口口蹄蹄疫疫疫疫苗苗、甲甲型型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、单克隆抗体等肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、单克隆抗体等l在在过过去去几几十十年年来来，该该技技术术经经有有了了很很
7、大大发发展展，从从使使用用转转瓶瓶培养，发展为生物反应器进行大规模细胞培养培养，发展为生物反应器进行大规模细胞培养l细细胞胞培培养养技技术术核核心心问问题题是是难难以以产产业业化化或或者者说说是是规规模模化化生生产产：一一是是在在工工艺艺生生产产时时不不能能大大规规模模制制备备产产品品；二二是是非非批批量量生生产产容容易易导导致致产产品品质质量量的的不不均均一一性性；三三是是难难以以对对同同批批生产进行生产和质量控制生产进行生产和质量控制大规模培养细胞的途径大规模培养细胞的途径n动物细胞大规模培养包括悬浮培养和固定化培养动物细胞大规模培养包括悬浮培养和固定化培养n两两种种培培养养技技术术的的发
8、发展展近近年年来来主主要要表表现现在在借借助助不不同同的的生生物物反反应器应器n通通过过优优化化培培养养工工艺艺，提提高高细细胞胞密密度度来来生生产产有有应应用用价价值值的的细细胞产品胞产品固定化培养固定化培养n固固定定化化细细胞胞培培养养是是将将细细胞胞限限定定或或定定位位于于特特定定空空间间位位置置的的培培养技术养技术n固定化细胞培养包括传统的转瓶培养和微载体培养等固定化细胞培养包括传统的转瓶培养和微载体培养等n微微载载体体培培养养是是目目前前公公认认的的最最有有发发展展前前途途的的一一种种动动物物细细胞胞大大规规模模培培养养技技术术，其其兼兼具具悬悬浮浮培培养养和和贴贴壁壁培培养养的的优
9、优点点，放放大大比比较较容容易易。目目前前微微载载体体培培养养广广泛泛用用于于培培养养各各种种类类型型细细胞胞，如如VeroVero细细胞胞、CHOCHO、BHK21BHK21等等传传代代细细胞胞。用用微微载载体体培培养养原原代代细胞，目前鲜有成功的报道细胞，目前鲜有成功的报道n尝试用生物反应器进行原代细胞微载体尝试用生物反应器进行原代细胞微载体培养探索性研究培养探索性研究细胞悬浮培养法细胞悬浮培养法n细胞在培养液中，呈悬浮状态进行繁殖，能连续培养和连细胞在培养液中，呈悬浮状态进行繁殖，能连续培养和连续收获续收获n成本低，工艺参数放大和控制简单，适用于多种细胞培养成本低，工艺参数放大和控制简单
10、，适用于多种细胞培养n用用WAVE波浪式生物反应器进行波浪式生物反应器进行MCDK细胞悬浮培养细胞悬浮培养对生物反应器的要求对生物反应器的要求n生生物物反反应应器器应应有有良良好好的的生生物物相相容容性性，接接近近细细胞胞在在动动物物体体内内的生长环境的生长环境n能能精精确确地地控控制制温温度度、酸酸碱碱度度、溶溶解解氧氧和和C0C02 2浓浓度度等等条条件件。必必须须满满足足物物质质（特特别别是是氧氧）传传递递的的要要求求。有有能能力力加加入入热热量量，加热均匀，无过热点或冷点加热均匀，无过热点或冷点n有优良的防污染性能。能严格保证无菌环境有优良的防污染性能。能严格保证无菌环境n便便于于操操
11、作作和和维维护护。能能够够方方便便地地实实现现培培养养液液的的连连续续添添加加、样品的采样和观察样品的采样和观察n混混合合系系统统设设计计应应能能提提供供均均匀匀、温温和和的的混混合合状状态态，剪剪切切力力小，保证良好的传质效果小，保证良好的传质效果n反反应应器器内内空空间间利利用用率率高高，选选用用合合适适的的载载体体系系统统和和材材料料，易于放大易于放大生物反应器的特点分析生物反应器的特点分析n由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切敏感以及对由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求，传统的微生物发酵反应器不体外培养环境有严格的要求，传统的微生物发酵反应器
12、不适用于动物细胞的大量培养，因而对动物细胞培养用反应适用于动物细胞的大量培养，因而对动物细胞培养用反应器的设计和过程控制提出了特殊的要求器的设计和过程控制提出了特殊的要求n细胞培养用生物反应器的种类越来越多，规模也越来越大，细胞培养用生物反应器的种类越来越多，规模也越来越大，反应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固定床为主反应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固定床为主 作为用户，首先要考虑产品的质量作为用户，首先要考虑产品的质量n结构严密，能蒸汽或其他方式灭菌，实现长期的无菌结构严密，能蒸汽或其他方式灭菌，实现长期的无菌性要求。大规模培养动物细胞是一项复杂而且经验性性要求。大规模培养动物
13、细胞是一项复杂而且经验性很强的工作，保证培养环境的无毒、无菌，防止污染很强的工作，保证培养环境的无毒、无菌，防止污染是进行大规模培养的前提是进行大规模培养的前提n良好的流体混合功能，即良好的气液接触和液固混和良好的流体混合功能，即良好的气液接触和液固混和性能和热量交换性能，使质量与热量传递有效地进行性能和热量交换性能，使质量与热量传递有效地进行n由于动物细胞对反应器搅拌产生的剪切力敏感，因此由于动物细胞对反应器搅拌产生的剪切力敏感，因此搅拌转速在满足均匀混合的前提下，应越低越好搅拌转速在满足均匀混合的前提下，应越低越好n有可靠的参数检测和控制系统，并且系统稳定性高有可靠的参数检测和控制系统，并
14、且系统稳定性高生物反应器的选择生物反应器的选择 供应商的售后技术支持供应商的售后技术支持n 真正利用生物反应器实现过程优化是有难度的，真正利用生物反应器实现过程优化是有难度的，从理论到实践的提高，并进一步在生物技术产品生产从理论到实践的提高，并进一步在生物技术产品生产中发挥作用，需要有一个过程，但是市场竞争激烈，中发挥作用，需要有一个过程，但是市场竞争激烈，需要缩短产品实现的时间，因此生物反应器供应商应需要缩短产品实现的时间，因此生物反应器供应商应具有售后培训工作使生物制品厂家能够快速掌握反应具有售后培训工作使生物制品厂家能够快速掌握反应器操作技术，使生物制品厂家把精力集中在生产工艺器操作技术
15、，使生物制品厂家把精力集中在生产工艺等产品实现的关键工作；此外生物反应器厂家要做好等产品实现的关键工作；此外生物反应器厂家要做好售后服务工作，以保证生物制品厂家能够最大程度的售后服务工作，以保证生物制品厂家能够最大程度的利用生物反应器进行产品生产利用生物反应器进行产品生产展望n可以推断，更多的代谢中间产物对细胞培养的细微可以推断，更多的代谢中间产物对细胞培养的细微影响和机理将逐渐得以充分认识。对这些因素加以影响和机理将逐渐得以充分认识。对这些因素加以调节可以简化筛选特定培养的方法，维持或增加产调节可以简化筛选特定培养的方法，维持或增加产品质量的可控性和一致性品质量的可控性和一致性n随着对细胞生长和产物生成之间相关性研究的深入，随着对细胞生长和产物生成之间相关性研究的深入，对生物反应器更多培养状态参数的在线检测以及各对生物反应器更多培养状态参数的在线检测以及各种新细胞生物反应器系统的开发利用，新的培养、种新细胞生物反应器系统的开发利用，新的培养、控制模式将会在现有基础上不断产生控制模式将会在现有基础上不断产生
