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1、基因工程的基本内容1基因工程的基本内容1.引入2.基因工程的概念3.基因操作的工具4.基因操作的基本步骤5.小结2基因决定性状（一）青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素3基因决定性状（二）v家蚕能够吐出蚕丝为人类利用4基因决定性状（三）v豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮5定向基因改造设想 设想设想一一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌能否让细菌能否让细菌能否让细菌“ “吐出吐出吐出吐出” ”蚕丝蚕丝蚕丝蚕丝？设想设想二二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等能否让微
2、生物产生出人的胰岛素、干扰素等能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？珍贵的药物？珍贵的药物？珍贵的药物？设想设想三三经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于20202020世纪世纪世纪世纪70707070年代创立年代创立年代创立年代创立了可以定向改造生物的新技术了可以定向改造生物的新技术了可以定向改造生物的新技术了可以定向改造生物的新技术基因工程。基因工程。67基因工程概念基因工程：在生物体外，通过对在生物体外，通过对DNADNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物
3、的基因进行改造和重新组合，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。胞内表达，产生出所需要的基因产物。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基 因操作水平DNA分子水平基本过程剪切拼接导入表达结果人类需要的基因产物8基因工程的特点基因工程的特点基基因因工工程程有有两两个个基基本本的的特特点点分分子子水水平平上上的的操操作和细胞水平上的表达作和细胞水平上的表达。基基因因工工程程技技术术的的诞诞生生使使人人们们能能够够在在试试管管里里进进行行分分子子水
4、水平平上上的的操操作作，象象一一项项工工程程那那样样，进进行行按按图图施施工工的的操操作作，构构建建在在生生物物体体内内难难以以进进行行的的重重组组体体，然然后后将将重重组组的的遗遗传传物物质质引引入入相相应应的的宿宿主主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。细胞，让其在宿主细胞中进行工作。这这实实际际上上是是进进行行无无性性繁繁殖殖，即即克克隆隆，所所以以基基因因工程通常又称为基因克隆工程通常又称为基因克隆。9基因工程的对象是基因，所以如果是获得商品的话，就是基基因因的的产产品品，或是改变了遗传性的细细胞胞和个个体体。如果要获得效益的话，除了经济效益之外，还有巨大的社会效益。基因工程的对象是基因，
5、而基基因因要要安安居居才才能能乐乐业业，也就是说基因需要在宿主细胞中工作。它它需要在体外操作，然后送到细胞中去进行表现需要在体外操作，然后送到细胞中去进行表现。基因工程的特点基因工程的特点10基因操作的工具v基因的剪刀限制性内切酶v基因工程过程示意图v基因的针线DNA连接酶v基因的运输工具运载体11基因工程过程示意图从细胞中分从细胞中分从细胞中分从细胞中分离出离出离出离出DNADNADNADNA限制酶截取限制酶截取限制酶截取限制酶截取DNADNADNADNA片断片断片断片断分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒 DNADNADNADNA重组重组重组重组
6、用重组质粒用重组质粒用重组质粒用重组质粒转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因12基基因因克克隆隆操操作作13限制性内切酶1.分布：主要在微生物中。主要在微生物中。2.特点：特特异异性性，即即识识别别特特定定核核苷苷酸酸序序列，切割特定切点。列，切割特定切点。3.结果：产产生生黏黏性性未未端端（碱碱基基互互补补配配对对）。4.举例：大大肠肠杆杆菌菌的的一一种种限限制制酶酶能能识识别别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。14v一种限制酶只能识别一种
7、特定的核苷一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将酸序列，并在特定的切割点上将DNA DNA 分分子切断。目前已发现的限制酶有子切断。目前已发现的限制酶有200200多多种。种。553315DNA连接酶v连接酶的作用：将互补配对的两个黏将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整性末端连接起来，使之成为一个完整的的DNADNA分子。分子。v连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。磷酸二酯键，不是氢键。vDNA连接酶的作用过程16DNA连接酶的作用原理17DNA连接酶的作用过程18运载体1.作用：将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。2.条件：1)能在宿主细胞内复制
8、并稳定地保存。2)具有多个限制酶切点。3)具有某些标记基因3.种类：质粒质粒、噬菌体和动植物病毒。、噬菌体和动植物病毒。4.4.质粒的特点质粒的特点要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是内去。能将外源基因送入细胞的工具就是内去。能将外源基因送入细胞的
9、工具就是内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体运载体。19质 粒20质粒的特点1.细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子；2.质粒是基因工程中最常用的运载体；3.最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；4.存在于许多细菌及酵母菌等生物中；5.质粒的存在对宿主细胞无影响；6.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。21基因操作的基本步骤v提取目的基因v目的基因与运载体结合v将目的基因导入受体细胞v目的基因的检测和表达一v目的基因的检测和表达二22提取目的基因v将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。取取 出出DNADNA用限制酶用限制酶切断切断DNADNA 目前被较广目前被较广目前被较广目前被较广泛提取使
10、用的目的泛提取使用的目的泛提取使用的目的泛提取使用的目的基因有：苏云金杆基因有：苏云金杆基因有：苏云金杆基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰菌抗虫基因、人胰菌抗虫基因、人胰菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰岛素基因、人干扰岛素基因、人干扰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏素基因、种子贮藏素基因、种子贮藏素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗蛋白基因、植物抗蛋白基因、植物抗蛋白基因、植物抗病基因等。病基因等。病基因等。病基因等。23提取目的基因的方法（一）v 直接分离基因鸟枪法 将供体生物的将供体生物的将供体生物的将供体生物的DNADNADNADNA用限制用限制用限制用限制酶切割为许多片段，再用运载酶切割为许
11、多片段，再用运载酶切割为许多片段，再用运载酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生体将这些片段都运载到受体生体将这些片段都运载到受体生体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一物的不同细胞中去。只要有一物的不同细胞中去。只要有一物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因个细胞获得了需要的目的基因个细胞获得了需要的目的基因个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成并得以表达，基因工程就算成并得以表达，基因工程就算成并得以表达，基因工程就算成功了。功了。功了。功了。该法最大的缺点是带有很该法最大的缺点是带有很该法最大的缺点是带有很该法最大的缺点是带有很大的
12、盲目性，工作量大，成功大的盲目性，工作量大，成功大的盲目性，工作量大，成功大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基率低。且不能将真核生物的基率低。且不能将真核生物的基率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。因转移到原核生物中去。因转移到原核生物中去。因转移到原核生物中去。用限制酶用限制酶用限制酶用限制酶切成许多切成许多切成许多切成许多片断片断片断片断24提取目的基因的方法（二）v 人工基因合成法1.1.逆转录法：以信使逆转录法：以信使逆转录法：以信使逆转录法：以信使RNARNARNARNA为模板，在逆转录酶的为模板，在逆转录酶的为模板，在逆转录酶的为模板，在逆转录酶的作用下
13、将脱氧核苷酸合作用下将脱氧核苷酸合作用下将脱氧核苷酸合作用下将脱氧核苷酸合成合成成合成成合成成合成DNA(DNA(DNA(DNA(基因基因基因基因) ) ) )。2.2.直接合成法：根据蛋白直接合成法：根据蛋白直接合成法：根据蛋白直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出质的氨基酸顺序推算出质的氨基酸顺序推算出质的氨基酸顺序推算出信使信使信使信使RNARNARNARNA核苷酸顺序，核苷酸顺序，核苷酸顺序，核苷酸顺序，再据此推算出基因再据此推算出基因再据此推算出基因再据此推算出基因DNADNADNADNA的脱氧核苷酸顺序。用的脱氧核苷酸顺序。用的脱氧核苷酸顺序。用的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸
14、直接合游离脱氧核苷酸直接合游离脱氧核苷酸直接合游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。成相应的基因。成相应的基因。成相应的基因。DNA合成仪PCR扩增仪25目的基因与运载体结合v用与提取目的基因相同用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用对后，在连接酶的作用下连接形成下连接形成重组重组DNADNA分分子子。提取质粒并用提取质粒并用提取质粒并用提取质粒并用限制酶切割限制酶切割限制酶切割限制酶切割用连接酶将
15、目的用连接酶将目的用连接酶将目的用连接酶将目的基因和质粒连接基因和质粒连接基因和质粒连接基因和质粒连接26将目的基因导入受体细胞并扩增v基因工程中常用的受体细胞有基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。杆菌和动植物细胞等。v导入受体细胞常用的方法是借导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常还要对一些受体细胞径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理。进行增大通透性的处理。v目的基因可以随着受体细胞进目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的
16、基因。内获得大量的基因。将目的基因导将目的基因导将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞入受体细胞入受体细胞将受体细胞将受体细胞将受体细胞将受体细胞进行扩增进行扩增进行扩增进行扩增27目的基因的检测和表达（一） 前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成细菌的检测，将每个受
17、体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。步培养、研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物28目的基因的检测和表达（二）v多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰
18、无变化的个体，保留有相应变化的个体进一。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到明摄入了抗虫基因并得到表达。表达。29体外体外操作操作与细与细胞内胞内表达表达30基因工程技术的诞生基因工程技术的诞生1 1 基因工程的技术准备基因工程的技术准备 基基因因工工程程技技术术的的诞诞生生不不仅仅依依赖赖于于基基因因分分子子生生物物学学理理
19、论论的的发发展展，同同时时也也有有赖赖于于一一些些重重要要的的分分子子生生物物学学研研究究方方法法的的建建立立。最最重重要要的的技技术术准准备备是是限限制制性性酶酶的的分分离离纯纯化化、DNADNA连连接接酶酶的的分分离离、大大肠肠杆杆菌菌转转化化技技术术的的突突破破。到到19701970年年，这这三三大大技技术术都都已已经经建建立立，“万万事事齐齐备备，只只欠欠东东风风”了了。到到了了1972197219731973年年，两两位位科科学学助助产产士士BergBerg和和CohenCohen将将基基因因工工程接到了人间。程接到了人间。31基因工程技术的诞生基因工程技术的诞生32 第一个重组体的
20、构建第一个重组体的构建 1972年，美国斯坦福大学年，美国斯坦福大学P.Berg等在等在PNAS上发表了题为上发表了题为“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”，标志着基
21、因工程标志着基因工程技术的诞生技术的诞生。33第第一一个个重重组组体体构构建建34 SV40病病毒毒是是猿猿猴猴病病毒毒，是是一一种种直直径径为为450的的球球形形病病毒毒，分分子子量量为为28106道道尔尔顿顿。SV40的的DNA是是环环状状双双链链结结构构，全全长长5243个个碱碱基基对对。SV40DNA上上有有一个限制性内切酶一个限制性内切酶EcoR的切点的切点。35SV40病毒病毒36当当获获得得二二聚聚体体SV40DNA后后，Berg等等就就证证明明了了环环状状DNA被被内内切切酶酶切切成成线线性性DNA后后能能够够重重新新环环化化，并并且且能能够够同同另另外外的分子重组。的分子重组
22、。 于于是是他他们们进进行行第第二二步步的的实实验验就就是是从从dvgal DNA中中制制备备含含有有E.coli的的半半乳乳糖糖操操纵纵子子DNA，用用上上述述同同样样的的方方法法进进行行重组连接，并获得成功重组连接，并获得成功。37 第一个有功能重组体的构建第一个有功能重组体的构建虽然虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。分子具有生物学功能。1973年，年，Cohen等在美国等在美国PNAS上发表了题为上发表了题为“Construction of Biologically Functio
23、nal Bacterial Plasmid In Vitro” （S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Borer, and R. B. Helling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244, 1973） 的论文，的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达表达,从而完善从而完善了了Berg开创的基因重组技术开创的基因重组技术。38Boyer and Cohen39质粒质粒 pSC101的获得的获得In 1972, Cohen constructed a new plasmi
24、d beginning with DNA isolated from E. coli. Cohen named the plasmid pSC101 (“SC for Stanley Cohen).The new plasmid had three important features: (1)it had only a single recognition site where EcoRI would cut the molecule, thus identifying the spot where the plasmid would open; (2) it had a sequence
25、of nucleotides called an origin of replication, which is needed to initiate DNA replication; such a sequence stimulates plasmids to multiply in a host organism; (3) it contained a gene for resistance to the antibiotic tetracycline; thus, bacteria having the plasmid could resist the effects of tetrac
26、ycline, whereas bacteria lacking the plasmid would be killed by the tetracycline. Cohen在重组在重组DNA技术中杰出贡献技术中杰出贡献40pSC101质粒质粒DNA41质粒质粒 pSC101对对大肠杆菌的转化技术突破大肠杆菌的转化技术突破 Another key characteristic of Cohens plasmid was the ease of inserting it to a host cell. Cohen found that he could insert plasmids to fr
27、esh bacteria by suspending the latter in cold calcium chloride, then rapidly heating the bacteria to 42oC. So treated, the bacterial wall and plasma membrane open to permit the plasmids to pass through and into the cytoplasm.Cohen在重组在重组DNA技术中杰出贡献技术中杰出贡献42Cohen与与Boyer合作创建重组合作创建重组DNA分子分子 To some histo
28、rians, the discipline of DNA technology came into being over pastrami sandwiches at a local delicatessen in Waikiki Beach. The year was 1972. It happened that Herbert Boyer was at a scientific conference in Hawaii speaking about the EcoRl restriction enzyme. Stanley Cohen was in the audience. After
29、the presentation, Cohen invited Boyer to lunch to explore their possible collaboration on a series of experiments. The two researchers sat and considered the experiments that would send DNA technology into a new era.Cohen在重组在重组DNA技术中杰出贡献技术中杰出贡献43Cohen与与Boyer合作创建重组合作创建重组DNA分子分子Cohen had been conducti
30、ng fruitful experiments with plasmids, but he was experiencing difficulty cutting open the plasmids. Boyers EcoRI enzyme seemed to be the ideal solution, so Cohen suggested they join forces. They would use his plasmids and Boyers enzyme to recombine the plasmid DNA. First they would try to recombine
31、 two plasmids to form a single plasmid. If successful, they would attempt to bring DNA from a foreign species into the plasmid to produce a recombinant DNA molecule. Boyer agreed, and the bargain was struck.Cohen在重组在重组DNA技术中杰出贡献技术中杰出贡献44Boyer and Cohen 的策略的策略45pSC102,体内构建的重组体体内构建的重组体他他们们首首先先检检查查了了Ec
32、oR对对质质粒粒pSC101和和R6-5的的切切割割情情况况，发发现现EcoR在在质质粒粒pSC101上上只只有有一一个个切切点点，在在质质粒粒R6-5上上有有12个个切切点点,这这样样就就可可以以用用pSC101作作为为重组重组DNA的载体分子。的载体分子。46 他他们们用用EcoR处处理理过过的的和和没没有有处处理理过过的的质质粒粒pSC101和和R6-5DNA分别转化分别转化E.coli C600,得到下表的实验结果得到下表的实验结果 表：环状和线状质粒表：环状和线状质粒DNA的转化的转化质粒质粒DNA每每g DNA转化子转化子四环素四环素卡那霉素卡那霉素氯霉素氯霉素pSC101(未切割
33、未切割)3105-(EcoR切割切割)2.8104-R6-5(未切割未切割)-1.31041.3104R6-5 (EcoR切割切割) 51102410147 他他们们从从用用EcoR处处理理的的R6-5的的卡卡那那霉霉素素抗抗性性平平板板上上选选择择了了一一个个克克隆隆，并并检检查查了了它它的的抗抗性性，发发现现该该克克隆隆同同时时具具有有磺磺胺胺的的抗抗性性，但但没没有有氯氯霉霉素素、四四环环素素的的抗抗性性。然然后后从从该该克克隆隆中中分分离离了了一一个个环环状状质质粒粒DNA，命命名为名为pSC102，分子量大约为分子量大约为17106。48接接着着用用EcoR分分别别切切割割pSC10
34、2 和和R6-5质质粒粒DNA，进进行行电电泳泳检检查查，发发现现pSC102被被切切成成三三个个片片段段，相相对对于于质质粒粒R6-5的的EcoR酶酶切切片片段段、和和。这这些些结结果果说说明明不不同同的的酶酶切切片片段段转转化化大大肠肠杆杆菌菌后后能能够够在在细细胞胞内内进进行行重重组组连连接接形形成成有有功功能能的的重重组组质质粒粒。这这一一结结果果也也提提示示，如如果果能能够够在在体体外外重重组组成成功功，并并能能将将重重组组体体引引入入细细胞胞内内，同同样样具具有有生生物学功能。物学功能。49 pSC105，体外构建的重组体体外构建的重组体作作者者为为了了获获得得体体外外构构建建的的
35、重重组组体体，分分别别用用EcoR切切割割质质粒粒pSC101 和和pSC102,然然后后加加入入DNA连连接接酶酶进进行行连连接接后后转转化化大大肠肠杆杆菌菌，在在四四环环素素和和卡卡那那霉霉素素双双抗抗性性的的平平板板上上检检查查重重组组情情况况，同时设计一些合理的对照实验。同时设计一些合理的对照实验。50 质粒质粒DNA抗生素抗性的转化频率抗生素抗性的转化频率四环素四环素卡那霉素卡那霉素四环素四环素卡那霉素卡那霉素未用酶处理未用酶处理210511052102EcoR处理处理1.21041.11037101 EcoR+ DNA连接酶连接酶1.21041.31035.7102表：质粒表：质粒
36、pSC101 和和pSC102混合混合DNA的的 大肠杆菌大肠杆菌C600的转化的转化51pSC101与与RSF1010的共整合的共整合: pSC109的构建的构建象象pSC101一一样样，质质粒粒RSF1010上上也也只只有有一一个个EcoR切切点点，所所以以只只要要用用EcoR分分别别处处理理质质粒粒RSF1010和和pSC101，然然后后用用DNA连连接接酶酶将将两两个个线线性性DNA连连接接起起来来转转化化大大肠肠杆杆菌菌，得得到到一一个个具具有有三三种种抗抗性性的的重重组组质质粒粒 四环素抗性、链霉素抗性、磺胺抗性。四环素抗性、链霉素抗性、磺胺抗性。这这种种重重组组说说明明两两个个复复制制子子能能够够重重组组，并并能能在在细细胞胞内内表达。表达。52可可用用分分/ /合合成成、切切、连连（接接）、转转、选选、鉴六个字表示。鉴六个字表示。基因操作的基本过程基因操作的基本过程53外源外源基因基因的克的克隆与隆与表达表达54基基因因工工程程的的技技术术组组合合55基基因因工工程程的的应应用用56基因工程的基础与应用基因工程的基础与应用57
