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1、序列分析软件序列分析软件DNAMAN的的使用方法简介使用方法简介饶志明饶志明 博士/教授 博士生导师江南大学生物工程学院工业微生物中心江南大学生物工程学院工业微生物中心江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学工业生物技术教育部重点实验室E-mail: 1nDNAMAN是一种常用的核酸序列分析软是一种常用的核酸序列分析软件。由于它功能强大，使用方便，已成件。由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的为一种普遍使用的DNA序列分析工具。序列分析工具。2打开打开DNAMAN，可以看到如下界面：，可以看到如下界面：n第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十个第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十
2、个常用主菜单，常用主菜单，n第二栏为工具栏：第二栏为工具栏：n第三栏为浏览器栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区在浏览器栏下方的工作区左侧，可见左侧，可见Channel工具条，工具条，DNAMAN提供提供20个个Channel，点击，点击Channel工具条上相应工具条上相应的数字，即可击活相应的的数字，即可击活相应的Channel。n每个每个Channel可以装入一个序列。将要分析的可以装入一个序列。将要分析的序列（序列（DNA序列或氨基酸序列）放入序列或氨基酸序列）放入Channel中可以节约存取序列时间，加快分析中可以节约存取序列时间，加快分析速度。速度。34如何使用如何使用DN
3、AMAN分析序列分析序列n1将待分析序列装入将待分析序列装入Channeln通过通过FileOpen命令打开待分析序列文件，则命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认打开的序列自动装入默认Channel。n通过通过Sequence/LoadSequence菜单的子菜菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入单打开文件或将选定的部分序列装入Channel。n通过通过Sequence/CurrentSequence/AnalysisDefination命令打开命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（质（DNA或蛋白质），名称，要分析的片段
4、或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。等参数。52以不同形式显示序列以不同形式显示序列n通过通过Sequence/DisplaySequence命令打开对话框，命令打开对话框，n根据不同的需要，可以选择显示不同的根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。序列转换形式。n对话框选项说明如下：对话框选项说明如下：nSequence&Composition显示序列和显示序列和成分成分62以不同形式显示序列以不同形式显示序列nReverseComplementSequence显示待分显示待分析序列的反向互补序列析序列的反向互补序列nReverseSequence显示待分析序列的反向显示待分析序列
5、的反向序列序列nComplementSequence显示待分析序列的显示待分析序列的互补序列互补序列nDoubleStrandedSequence显示待分析序显示待分析序列的双链序列列的双链序列nRNASequence显示待分析序列的对应显示待分析序列的对应RNA序列序列73DNA序列的限制性酶切位点分析序列的限制性酶切位点分析n将待分析的序列装入将待分析的序列装入Channel，点击要分析的，点击要分析的Channel，然后通过，然后通过Restriction/Analysis命令打开命令打开对话框，对话框，n参数说明如下：参数说明如下：nResults分析结果显示分析结果显示n其中包括：其
6、中包括：nShowsummary（显示概要）（显示概要）nShowsitesonsequence（在结果中显示酶切位点）（在结果中显示酶切位点）nDrawrestrictionmap（显示限制性酶切图）（显示限制性酶切图）nDrawrestrictionpattern（显示限制性酶切模式图）（显示限制性酶切模式图）83DNA序列的限制性酶切位点分析序列的限制性酶切位点分析nIgnoreenzymeswithmorethan（忽略大于某设（忽略大于某设定值的酶切位点）定值的酶切位点）nIgnoreenzymeswithlessthan（忽略小于某设定（忽略小于某设定值的酶切位点）值的酶切位点）n
7、TargetDNA（目标（目标DNA特性）特性）nCircular（环型（环型DNA），），ndam/dcmmethylation（dam/dcm甲基化）甲基化）nallDNAinSequenceChannel（选择此项，在（选择此项，在SequenceChannel中的所有序列将被分析，如果选中的所有序列将被分析，如果选择了择了Drawrestrictionpattern，那么当所有的，那么当所有的channel中共有两条中共有两条DNA时，则只能选择两个酶分析，时，则只能选择两个酶分析，如果共有三个以上如果共有三个以上DNA时，则只能用一个酶分析。）时，则只能用一个酶分析。）9n选择所需的
8、项目，然后按提示操作点击按扭，出现下选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下列对话框：列对话框：n参数说明如下：参数说明如下：nEnzymen代表（代表（enzymedatafile），点击旁边的下拉按钮，），点击旁边的下拉按钮，出现两个默认选项，出现两个默认选项，restrict.enz和和dnamane.enz，n如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文件名。件名。n其中其中restrict.enz数据文件包含数据文件包含180种限制酶，种限制酶，dnamane.enz数据文件包含数据文件包含2524种限制酶。种限制酶。n选择其中一
9、个数据文件，相应的酶在左边的显示框中选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则对应的酶被选中，在右边空白框中列出。对应的酶被选中，在右边空白框中列出。10n要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例如如puc18multiplecloningsites），），n然后点击按钮出现下列对话框：然后点击按钮出现下列对话框：n输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可以
10、方便分析特定的酶切位点。以方便分析特定的酶切位点。nCutter酶切识别序列长度；酶切识别序列长度；nEnd酶切产生的末端，其中包括，酶切产生的末端，其中包括，nBlunt（平头末端），（平头末端），n5Overhang（5突出粘性末端）突出粘性末端）,n3Overhang(3突出粘性末端突出粘性末端)，n系统根据系统根据cutter和和end的设定情况的设定情况,在左边酶列表中显示符合条在左边酶列表中显示符合条件的酶。最后，点击按钮执行操作。件的酶。最后，点击按钮执行操作。114DNA序列比对分析序列比对分析（DotMatrixComparision）n要比较两个序列，可以使用要比较两个序列
11、，可以使用DNAMAN提提供的序列比对工具供的序列比对工具DotMatrixComparision（点矩阵比较）通过（点矩阵比较）通过Sequense/Dotmatrixcomparision命令打开比对界面，命令打开比对界面，n点击对比界面左上角的按钮，出现下列点击对比界面左上角的按钮，出现下列对话框：对话框：12参数说明如下：nSequencetype序列类型序列类型nSequence1参加比对的第一序列选择框，框内选项参加比对的第一序列选择框，框内选项说明如下：说明如下：n如果要比对的序列在如果要比对的序列在Channel中，点击下拉箭头，选中，点击下拉箭头，选择相应的择相应的Chann
12、el，则被选中的，则被选中的Channel中的序列作中的序列作为参加比对的第一序列；为参加比对的第一序列；n也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在File选择选择框上点击即可。通过框上点击即可。通过Length选择参加比对的序列片选择参加比对的序列片段。段。nSequence2参加比对的第二序列选择框；选项说明参加比对的第二序列选择框；选项说明同上同上nShowSequence选择此项，当同源性大于设定值时，选择此项，当同源性大于设定值时，将显示同源性；将显示同源性；13nAnnotations是否显示注释是否显示注释nComparision比对参数，比对
13、参数，n其中其中Window代表代表Windowsize（单位比对长度），（单位比对长度），nMismatch代表代表Mismatchsize（单位比对长度中许（单位比对长度中许可的错配值）要快速比对，需将此项设为可的错配值）要快速比对，需将此项设为0。nBothstran代表代表Bothstrand（双链比对）选择此项，（双链比对）选择此项，是指用是指用Sequence2中的序列的正链和负链分别和中的序列的正链和负链分别和Sequence1比较。比较。nSequence2正链与正链与Sequence1比较结果用黑色点比较结果用黑色点表示，表示，Sequence2负链比对结果用红色点表示。负链
14、比对结果用红色点表示。14nPlotbox点阵图表显示参数，点阵图表显示参数，nPosition（起点坐标）（起点坐标）nWidth（宽度值）（宽度值）nHeight（高度值）（高度值）nFramesize（边框线粗度值）（边框线粗度值）nDotsize（点粗度值）（点粗度值）nGridline（虚线框数）。（虚线框数）。n参数设定好后，点击按钮执行操作。参数设定好后，点击按钮执行操作。155序列同源性分析序列同源性分析n（1）两序列同源性分析）两序列同源性分析n通过通过Sequence/TwoSequenceAlignment命令打命令打开对话框，如下所示：开对话框，如下所示：n参数说明如下
15、：参数说明如下：nAlignmentmethod比对方法，比对方法，n通常可选通常可选Quick(快速比对快速比对)或或Smith&Waterman(最最佳比对佳比对)，n当选择快速比对时，设置较小的当选择快速比对时，设置较小的k-tuple值，可以提值，可以提高精确度，高精确度，n当序列较长时，一般要设置较大的当序列较长时，一般要设置较大的k-tuple值。值。k-tuple值可选范围值可选范围26；n蛋白质序列：蛋白质序列：k-tuple值可选范围值可选范围13。16（2）多序列同源性分析）多序列同源性分析n通过打开通过打开Sequence/MultipleSequenceAlignmen
16、t命令打开对话框，命令打开对话框，n参数说明如下：参数说明如下：nFile从文件中选择参加比对的序列从文件中选择参加比对的序列nFolder从文件夹中选择参加比对的序列从文件夹中选择参加比对的序列nChannel从从channel中选择参加比对的序列中选择参加比对的序列nDbase从数据库中选择参加比对的序列从数据库中选择参加比对的序列nRemove清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的序列名选择）序列名选择）nClear清除全部序列清除全部序列17n点击按钮，出现方法选择对话框：点击按钮，出现方法选择对话框：n选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框：
17、选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框：n如果在前一对话框选择的是如果在前一对话框选择的是Fastalignment,则在此对话框中选则在此对话框中选择择Quickalignment,否则选择否则选择Dynamicalignment即可。其即可。其它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。n点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项：性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项：可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如
18、可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如Tree/homologytree命令）。命令）。n显示蛋白质二级结构（显示蛋白质二级结构（ProteinSecondaryStructure命令），命令），n绘制限制性酶切图（绘制限制性酶切图（RestrictionAnalysis命令）等。命令）等。186.PCR引物设计引物设计n首先，将目标首先，将目标DNA片段装入片段装入Channel,并激活并激活Channel。n点击主菜单栏中的点击主菜单栏中的Primer主菜单，出现下拉菜单，主菜单，出现下拉菜单，n点击点击DesignPCRPrimersforDNA命令，出现下列对话框：命令，出现下列对话框
19、：参数说明如下：参数说明如下：nPrimerlocationsontarget引物定位引物定位n其中包括下列选项：其中包括下列选项：nProductsize（扩增目的片段大小）（扩增目的片段大小）nSenseprimer(正向引物选择区正向引物选择区)nAntisenseprimer(反向引物选择区反向引物选择区)nPrimer引物特性包括引物特性包括Length(引物长度引物长度)，Tm值值,GC含量等参含量等参数；数；nRejectprimer引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）19n包括下列选项：包括下列选项：n3dimer(可形成可形成3
20、端自我互补的碱基数端自我互补的碱基数)nHairpinstem(可形成发卡颈环结构的碱基数可形成发卡颈环结构的碱基数)nPolyN(多聚碱基多聚碱基)n3Uique(3端严格配对碱基数端严格配对碱基数)nAllmatches(引物互补配对百分数引物互补配对百分数)nConsentrations浓度设定浓度设定nProductforhybridyzatnPCR产物用于产物用于SouthernBlot探针杂交探针杂交207画质粒模式图画质粒模式图n我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章，我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章，常常需要质粒图。常常需要质粒图。DN
21、AMAN提供强大的绘质粒图功能，能满足提供强大的绘质粒图功能，能满足我们的需要。我们的需要。n通过通过Restriction/Drawmap命令打开质粒绘图界面：命令打开质粒绘图界面：将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成“I”时，单击鼠标左键，出现时，单击鼠标左键，出现如下菜单：如下菜单：n菜单说明如下：菜单说明如下：nPosition当前位置当前位置nAddSite添加酶切位点添加酶切位点nAddElement添加要素添加要素nAddText添加文字添加文字nInsertFragment插入片断插入片断nCopyFragment复制片断复制片断nCutFragme
22、nt剪切片断剪切片断nRemoveFragment清除片断清除片断nFrameThickness边框线粗细调节边框线粗细调节21n点击点击AddSite选项，出现对话框：选项，出现对话框：n参数说明如下：参数说明如下：nName要添加的酶切位点的名称要添加的酶切位点的名称(例如例如HindIII)nPosition位置（以碱基数表示）位置（以碱基数表示）n点击点击AddElement选项，出现如下对话框：选项，出现如下对话框：参数说明如下：参数说明如下：nType要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换）要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换）nColor/Pattern填充色（共有填充色（
23、共有16种颜色供选择）种颜色供选择）nName要素名称要素名称nStart/End/Size要素起点要素起点/终点终点/粗细度粗细度22核酸序列的一般分析流程核酸序列的一般分析流程23n1.1核酸序列的检索核酸序列的检索http:/www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide1.2核酸序列的同源性分析核酸序列的同源性分析n1.2.1基于基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析软件的核酸序列同源性分析http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi1.2.2核酸序列的两两比较核酸序列的两
24、两比较http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmln1.2.3核酸序列的批量联网同源性分析核酸序列的批量联网同源性分析(方案方案)24n1.3核酸序列的电子延伸核酸序列的电子延伸1.3.1利用利用UniGene数据库进行电子延伸数据库进行电子延伸(方案方案)n1.3.2利用利用Tigem的的ESTMachine进行电子延伸进行电子延伸ESTExtractor:http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html|ESTAssembly:http:/www.tigem/ESTmachine.html1.3.3利用利用T
25、HC数据库对核酸序列进行电子延伸数据库对核酸序列进行电子延伸http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html25n1.4核酸序列的开放阅读框架分析核酸序列的开放阅读框架分析1.4.1基于基于NCBI/ORFfinder的的ORF分析分析http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htmln1.5基因的电子表达谱分析基因的电子表达谱分析n1.5.1利用利用UniGene数据库进行电子表达谱分析（方数据库进行电子表达谱分析（方案）案）n1.5.2利用利用Tigem的电子原位杂交服务器进行电子表达的电子原位杂交服务器进行电子表达谱分析谱
26、分析http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html26n1.6核酸序列的电子基因定位分析核酸序列的电子基因定位分析1.6.1利用利用STS数据库进行电子基因定位数据库进行电子基因定位http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/epcr.cgi1.6.2利用利用UniGene数据库进行电子基因数据库进行电子基因定位（方案）定位（方案）27n1.7cDNA的基因组序列分析的基因组序列分析1.7.1通过从通过从NCBI查询部分基因组数据库进行基因组查询部分基因组数据库进行基因组序列的分析序列的分析(方案方案)1.7.2通过从通过从
27、NCBI查询全部基因组数据库进行基因组查询全部基因组数据库进行基因组序列的分析序列的分析http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs1.7.3通过从通过从SangerCentre查询基因组数据库进行查询基因组数据库进行基因组序列的分析基因组序列的分析http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.shtml28n1.8基因组序列的初步分析基因组序列的初步分析1.8.1基因组序列的内含子基因组序列的内含子/外显子分析外显子分析http:/www.bioscience.org
28、/urllists/genefind.htm1.8.2基因组序列的启动子分析基因组序列的启动子分析http:/www-hgc.lbl.gov/projects/promoter.html29n1.9核酸序列的注册1.9.1EST序列的注册(方案)1.9.2较长或全长cDNA序列的注册(方案)n1.10待分析序列所对应的已知克隆的获取http:/image.llnl.gov30引物设计n引物n引物的重要性n引物设计的原则n引物与PCRn引物设计软件n如何使用PrimerPremier5.0n引物同源性分析31引物（primers)n引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条
29、DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。3355Sense primerAntisense primer32引物的重要性n在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。33引物设计原则n引物长度n碱基分布的均衡性nTm值n引物二级结构n引物3端n引物5端n引物的内部稳定性n引物的保守性与特异性n扩增区域的二级结构34引物长度n一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，
30、但最多不超过50个核苷酸。35碱基分布的均衡性n同一碱基连续出现不应超过5个nGC含量一般40-60%nGC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性nGC含量太高也易于引发非特异扩增。36引物Tm值n一般要求：55-65。n计算：n对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算n对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。nTm=H/(S+R*ln(C/4)+16.6log(K+/(1+0.7K+)-273.1537引物二级结构n引物二聚体n尽可能避免两个引物
31、分子之间3端有有较多碱基互补n发夹结构n尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。38引物3端n引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。39引物5端n引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。n5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。n5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。n5端标记放射性元素或非放射性物质（如生
32、物素、地高辛等）。40引物的内部稳定性n过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3端最好为G或C。n现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3端尽可能选用A或T，少用G或C。n仅仅3端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。n如果3端为富含G、C的结构，只需3端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。41引物的保守性与特异性n保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别n特异性：避免非特异性扩增42扩增区域的二级结构n模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应
33、使扩增区域尽可能避开这些区域。n扩增区域的自由能（G。）小于58.61kJ/moln引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30nTmproduct=81.5+16.6log(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-500/length43引物与PCRn引物浓度：一般为0.1-0.5umol/Ln引物浓度(uM)=nOD33/（A312C288G328T303-61）/VH2OVH2O(单位：L)n退火温度n最适退火温度（TaOpt）=0.3(Tmofprimer)+0.7(Tmofproduct)25n一般采用较引物Tm值低5作为PCR退火温度。44引物设计软件nPrimerPr
34、emier5.0n生物软件网下载n安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。nOligonprimer3nThePrimerGeneratornDNAMAN45如何使用PrimerPremier5.0n引物设计n一般引物设计n5带酶切位点引物设计n巢式PCR引物设计n多重PCR引物设计n探针设计n引物评析46引物同源性分析n用Blastn软件进行同源性比较n尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物n选择3端与非目的基因不同源的序列作为引物n选择两个引物3端与同一非目的基因不同源的序列作为引物47设计题目一设计题目一xx微生物微生物
35、xx酶基因的克隆及其在酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达n目的基因目的基因n编码如耐高温编码如耐高温-淀粉酶、生淀粉酶、普鲁兰酶、淀粉酶、生淀粉酶、普鲁兰酶、植酸酶、碱性甘露聚糖酶、脂肪酶、碱性蛋白植酸酶、碱性甘露聚糖酶、脂肪酶、碱性蛋白酶、谷氨酰胺转移酶、木聚糖酶、纤维素降解酶、谷氨酰胺转移酶、木聚糖酶、纤维素降解酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶、荧光素酶、葡酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶、荧光素酶、葡萄糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、已糖激萄糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、已糖激酶、葡萄酶、葡萄-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、尿酸酶、胆红素氧化
36、酶、吡喃葡萄酸脱氢酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、吡喃葡萄糖激酶、单宁酶糖激酶、单宁酶48n表达载体：表达载体：pET28a（+）-E. colin要求：找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序要求：找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序列，利用分析件进行目的基因内部限制性内切酶的酶列，利用分析件进行目的基因内部限制性内切酶的酶切分析及切分析及5和和3末端引物的设计末端引物的设计n提交具体的实验方案（从提取全基因组提交具体的实验方案（从提取全基因组DNA到目的基到目的基因克隆因克隆,与表达载体的重组、表达及活性分析）与表达载体的重组、表达及活性分析）n讨论，优化实验方案讨论，优化实验方案4950好的设计方案好的设计方案成功的一半成功的一半n要求提交打印稿和相应电子版n下学期第2周内完成（约3月15日左右）n鼓励提前完成n各个小组派一个代表报告其实验方案，全班同学对其进行讨论，找出不足和欠缺之处，并加以改正。51方案设计报告方案设计报告按照研究论文格式n标题n作者n摘要n前言n材料和方法n结果与讨论n参考文献52Thanks！53个人观点供参考，欢迎讨论
