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1、 第二章第二章 DNA复制复制 (DNA Replication) 第一节第一节 基本概念基本概念第二节第二节 复制概况复制概况第三节第三节 DNA复制的酶学复制的酶学 第四节第四节 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性第五节第五节 DNA复制复制第六节第六节 DNA损伤修复损伤修复 第五节第五节 DNA的复制的复制 (DNA replication in ProkaryoteDNA replication in Prokaryote) DNA复制结构的研究复制结构的研究 利用突变表型来考察基因的功能利用突变表型来考察基因的功能 但只能利用条件型突变但只能利用条件型突变温度敏感突变体温度敏感
2、突变体 材料材料: E.coli 或噬菌体或噬菌体一、复制的起始一、复制的起始二、复制的延伸二、复制的延伸三、复制的终止三、复制的终止Antibodies of dnaA黑色点：黑色点： oriC electron microscopy. 一、复制的起始一、复制的起始 oriC 四个四个9bp的重复序列的重复序列 dnaA结合位点结合位点 三个三个13bp的重复序列的重复序列若干若干GATC位点位点一、复制的起始点一、复制的起始点 oriC一、复制的起始点一、复制的起始点1 1 3-OH3-OH引发末端的产生引发末端的产生2 2 单链单链DNADNA的产生的产生3 3 复制复合体的形成复制复合
3、体的形成一、复制的起始一、复制的起始1 1、3-OH3-OH引发末端的产生引发末端的产生X174 噬菌体的噬菌体的DNA在在三种功能蛋白先后作用下三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：分开成为单链：在复制起始点在复制起始点，噬菌体，噬菌体A蛋白蛋白使病毒（使病毒（+）链产生）链产生缺口。缺口。Three proteins unwind X174 DNA A蛋白（蛋白（gpA）：）： x 174基因基因A的产物的产物 结合到合到 RFDNADNA的复制原点的的复制原点的结合位点合位点 （引（引发体的帮助）体的帮助） 诱导相相邻的的识别位点的熔解位点的熔解(负超螺旋、富含超螺旋、富含A/T) 其核酸
4、内切其核酸内切酶酶活力切割（）活力切割（）链的的4305与与4306碱基碱基 的的酯键，并共价，并共价连接于接于5端（端（A），另一端），另一端为自由的自由的 3OH（G）2 2 单链单链DNADNA的产生的产生解旋酶解旋酶( (helicasehelicase): ): 使使DNADNA的两条链分开，它通常利用的两条链分开，它通常利用ATPATP水解水解 来提供必需的能量来提供必需的能量X174 噬菌体的噬菌体的DNA在在三种功能蛋白先后作用下三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：分开成为单链：Rep蛋白蛋白提供解旋酶活性，提供解旋酶活性，它使两链分离。它使两链分离。Three protein
5、s unwind X174 DNA Rep蛋白蛋白解旋酶解旋酶 1)1)3)3)2)2)起始需要解旋酶、单起始需要解旋酶、单起始需要解旋酶、单起始需要解旋酶、单链结合蛋白和引物酶链结合蛋白和引物酶链结合蛋白和引物酶链结合蛋白和引物酶3 复制复合体的形成复制复合体的形成16DNADNA双链复制起始点双链复制起始点 dnaAdnaB/dnaCdnaB/dnaCDNADNA双链解开成双链解开成单链单链DNADNASSB引物酶引物酶RNARNA引物引物/3/3- -OHOHDNADNA聚合酶聚合酶dNTP和和3 3-OH-OH形成形成3 35 5磷酸二酯磷酸二酯键键解旋酶解旋酶解链酶SSBSSB3 3
6、3 35 55 5引发体引发体解链、解链、解旋酶解旋酶拓扑异构酶拓扑异构酶 涉及的主要酶系：涉及的主要酶系： DnaA、RNApol是必不可少的，此外涉及到是必不可少的，此外涉及到 DnaB（解旋酶）、（解旋酶）、 DnaC、Hu、Gyrase、 SSB、 DnaG、Top和和 DNApol 全全酶酶 二、延伸过程二、延伸过程 进入的标志：进入的标志：DNApol 把第一个核苷酸加到引物把第一个核苷酸加到引物 的的3OH端端1.在在DNA聚合酶聚合酶的作用下，的作用下，2.前导链前导链合成合成1000-2000个核苷酸后，个核苷酸后，3.随从链随从链开始合成，岗崎片段的长度开始合成，岗崎片段的
7、长度 为为1000-2000个（大肠杆菌）个（大肠杆菌） 4. Pol为不对称二聚体，为不对称二聚体， 一个作用于前导链，一个作用于前导链， 另一个作用于随从链另一个作用于随从链(loop)。参与复制延伸的蛋白质因子参与复制延伸的蛋白质因子(Dna G)(DnaB)复制体复制体21图12-14 位于复制叉处的多酶复合体（引发体）位于复制叉处的多酶复合体（引发体）必须快速必须快速 从一个冈崎片段移到另一冈崎片段从一个冈崎片段移到另一冈崎片段 In lagging Strand 上多酶系统上多酶系统 必须完成多次反复的启动与扩展必须完成多次反复的启动与扩展 E.coli 启动启动20004000次
8、的冈崎片段复制次的冈崎片段复制复复制制叉叉处处的的复复制制体体 前前导链和后随和后随链的的协同合成同合成聚合酶聚合酶全全酶酶前导链前导链后随链后随链螺旋酶螺旋酶引发体引发体引物引物引发酶引发酶活性中心一活性中心一活性中心一活性中心一活性中心二活性中心二活性中心二活性中心二PriA清除清除SSB提供引发体移提供引发体移动动力动动力极性极性35一分子的一分子的 DNA pol III. 协同合成前导链和后随链协同合成前导链和后随链2526553335图12-13 三、复制终止三、复制终止 1、环形形DNA复制的复制的终止止 a、终止序列止序列 E.coli 有两个有两个终止区域，分止区域，分别结合
9、合专一性的一性的终 止蛋白止蛋白 序列一：序列一：terE terD terA 序列二：序列二：terF terB terC 每个区域只每个区域只对一个方向的复制叉起作用一个方向的复制叉起作用 b、专一性终止蛋白、专一性终止蛋白 E.coli 中由中由 tus gene 编码编码 通过抑制通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用螺旋酶而发挥终止作用 每次复制时只使用一个终止位点每次复制时只使用一个终止位点ter2 2 染色体染色体DNADNA的末端复制的末端复制 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 RNARNARNARNA引物引物引物引物 3 3 3 3 3 3 3 3
10、RNA引物水解引物水解 即即DNADNA复制过程不能复制过程不能 自始至终自始至终 完整地复制整个线性染色体，完整地复制整个线性染色体，而是每次都在其而是每次都在其55末端留下一个空缺未能填补（即末端留下一个空缺未能填补（即RNARNA引物降解）引物降解），如果细胞没有办法添补这些空隙，如果细胞没有办法添补这些空隙，染色体染色体DNADNA将随着每一次的将随着每一次的细胞分裂而不断缩短，细胞分裂而不断缩短，直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡。使细胞消亡。 5 5 5 5 5 5 5 5 端粒的功能端粒的功能端粒给染色体末端提供了一个保护性的端粒给
11、染色体末端提供了一个保护性的“帽子帽子”，防止染色，防止染色体的融和、丢失和降解，并参与染色体和核基质的结合。体的融和、丢失和降解，并参与染色体和核基质的结合。DNADNA复制模型中存在复制模型中存在“末端复制问题末端复制问题”。真核细胞。真核细胞DNADNA复制需复制需要要RNARNA引物，复制完成时，引物，复制完成时，RNARNA引物被水解。这必然导致复制引物被水解。这必然导致复制的随从链的随从链5 5端有一段缺损，而端有一段缺损，而DNADNA聚合酶无法填补。聚合酶无法填补。根据此复制模型，染色体根据此复制模型，染色体DNADNA面临面临5 5端缩短的趋势。端缩短的趋势。端粒的端粒的存在
12、以其长度的缩短来阻止遗传信息的丢失，从而维持了基存在以其长度的缩短来阻止遗传信息的丢失，从而维持了基因组的完整性，解决因组的完整性，解决“末端复制问题末端复制问题” 。 33555533RNA引物水解引物水解端粒端粒 染色体染色体DNA DNA 端粒端粒末端复制补齐过程末端复制补齐过程 通过通过TG链的回折形成链的回折形成 发夹结构（发夹结构（GG氢键）氢键） 尺蠖模型尺蠖模型 端粒酶（端粒酶（ Telomerase）1985. Carol Greider & Blackburn, 1986. GottchlingGottchling 四膜虫四膜虫 端粒酶端粒酶 （ telomerase ）将
13、将T2G4 末端重复延伸末端重复延伸 游扑虫游扑虫 Telomerase = RNA CAAAACCCC 链链 + 末端结合蛋白末端结合蛋白 （TBP） 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶a、核蛋白（、核蛋白（ ribonucleoprotein RNP）b、含约长、含约长150NT的的RNA，其中含，其中含 15 拷贝的拷贝的CxAy重复序列，重复序列， 是合成端粒是合成端粒T2G4的模板的模板c、延长的、延长的3-T2G4端（端（一段一段cDNA）作为）作为5-端端DNA合成的模板合成的模板端粒酶端粒酶以自身含有的以自身含有的RNA作为模板，合成和补充端粒作为模板，合成和补充端粒的重复序列，具有
14、逆转录酶性质，的重复序列，具有逆转录酶性质，是一种是一种RNA依赖的依赖的DNA聚合酶，聚合酶，又称为端粒末端转移酶。又称为端粒末端转移酶。可以催化端粒可以催化端粒3 端的游离端的游离-OH基上连接新的基上连接新的dNTP以以延长端粒序列延长端粒序列。 端粒酶的功能端粒酶的功能端粒酶以其自身的端粒酶以其自身的RNARNA组分为模板，以原有的一条组分为模板，以原有的一条DNADNA单链的单链的3 3端游离端游离-OH-OH为引物，在端粒末端添加新为引物，在端粒末端添加新的端粒重复序列使端粒延长。端粒酶的作用解决了的端粒重复序列使端粒延长。端粒酶的作用解决了“末端复制问题末端复制问题”，保证真核细
15、胞线性染色体，保证真核细胞线性染色体DNADNA复复制得以完全制得以完全。端粒酶的活性决定了端粒的长度。端粒酶的活性决定了端粒的长度。无论单细胞或多细胞真核生物都存在各自特异的端无论单细胞或多细胞真核生物都存在各自特异的端粒酶粒酶RNARNA模板。模板。 5 55 5端粒消耗端粒维持细胞衰老细胞永生化染色体DNA端粒端粒39去除去除RNARNA引物引物补充空缺补充空缺连接连接 DNADNA聚合酶聚合酶的小片段的小片段 5 5 3 3外切酶外切酶DNADNA聚合酶聚合酶的大片段的大片段 3 3 5 5外切酶外切酶 5 5 3 3聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶复制忠实性的保证复制忠实性的保证
