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1、 第七章第七章细菌与病毒的微生物学检查法细菌与病毒的微生物学检查法教学大纲教学大纲o掌握内容n标本的采集和送检原则n病原菌的检验程序n细菌感染的血清学诊断及常用方法o了解内容n病原体的抗原成分、核酸及其他成分的检测方法病原学检查的目的病原学检查的目的o进行病因学诊断o指导合理用药o观察治疗o进行传染病的流行病学调查标本的采集和送检六原则标本的采集和送检六原则无菌操作：避免杂菌污染不同期不同标本用抗生素以前采集病变明显部位运送注意保存采集双份血清第一节第一节 细菌感染的微生物学检查法细菌感染的微生物学检查法可疑细菌感染可疑细菌感染采集标本血清学实验双份血清直接形态学检查细菌成分检测特异性抗体检测
2、细菌分离培养鉴定形态学检查生化学检查血清学鉴定药物敏感实验动物（毒力）实验抗原检测核酸检测直接凝集实验协同凝集实验乳胶凝集实验免疫荧光检测ELISA等核酸杂交聚合酶链反应（PCR）DNA芯片凝集反应沉淀反应补体结合试验中和试验ELISA等细菌学细菌学细菌学细菌学 诊断诊断诊断诊断 检测检测检测检测病原菌成分病原菌成分病原菌成分病原菌成分检测患者血清中特异性抗体检测患者血清中特异性抗体检测患者血清中特异性抗体检测患者血清中特异性抗体细菌细菌病原学病原学检查法检查法形态学检查形态学检查形态学检查形态学检查分离培养分离培养分离培养分离培养, , , ,纯培养纯培养纯培养纯培养生化试验生化试验生化试验
3、生化试验血清学鉴定血清学鉴定血清学鉴定血清学鉴定药物敏感试验药物敏感试验药物敏感试验药物敏感试验毒力实验毒力实验毒力实验毒力实验动物实验动物实验动物实验动物实验抗原抗原核酸核酸一、细菌学诊断一、细菌学诊断（一）形态学检查（一）形态学检查1.光学显微镜检查法：细菌染色检查法光学显微镜检查法：细菌染色检查法n革兰染色法n抗酸染色法n负染法2.暗视野检查：暗视野检查：用于检查活菌、螺旋体及其动力3.荧光显微镜荧光显微镜脑脊液的直接涂片染色脑脊液的直接涂片染色-肺炎链球菌肺炎链球菌链球菌链球菌淋病奈瑟球菌淋病奈瑟球菌-脓液直接涂片脓液直接涂片结核分枝杆菌结核分枝杆菌霍乱弧菌霍乱弧菌暗视野显微镜钩端螺旋
4、体肺炎双球菌病原菌的分离培养病原菌的分离培养/ /直接涂片直接涂片o大小大小o形态形态o颜色颜色o表面性状表面性状o透明度透明度o溶血性溶血性Flame sterilize wire loop, metal forceps, etc before and after use in a hooded Bunsen burner 细菌动力的检测细菌动力的检测化脓性球菌化脓性球菌葡萄球菌葡萄球菌链球菌链球菌肠道杆菌肠道杆菌大肠埃希菌大肠埃希菌沙门氏菌沙门氏菌志贺菌志贺菌细菌形态无特异性可采用生化细菌形态无特异性可采用生化学检查法学检查法- -鉴别细菌的重要方法鉴别细菌的重要方法（二）生化试验（二）生
5、化试验 糖发酵试验糖发酵试验 H2S试验试验 枸橼盐利用试验枸橼盐利用试验鉴定中最重要的生化反应鉴定中最重要的生化反应乳糖发酵试验乳糖发酵试验肠道非致病菌（埃希菌属）肠道非致病菌（埃希菌属）发酵乳糖、产酸产气发酵乳糖、产酸产气肠道致病菌（志贺菌属、肠道致病菌（志贺菌属、沙门菌属等）不发酵乳糖沙门菌属等）不发酵乳糖 （三）血清学鉴定（三）血清学鉴定o利用含已知的特异性抗体的免疫血清，检测未知的细菌抗原，对细菌进行种的鉴定 志贺菌属、沙门菌属o常用方法是玻片凝集试验o测定抗生素或其他抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力o方法： 扩散法、稀释法（四）药物敏感试验（四）药物敏感试验MIC & MBCn
6、最低抑菌浓度，MICn最低杀菌浓度，MBC全自动分析仪全自动分析仪全自动细菌鉴定仪全自动细菌鉴定仪全自动生化分析仪全自动生化分析仪（五）检测毒力（五）检测毒力- -动物实验动物实验1. 常用动物常用动物 MouseGuinea Pig Rabbit Dog Monkey接种途径接种途径皮内皮内 皮下皮下 腹膜内腹膜内 静脉静脉 颅内颅内 椎管内椎管内 鼻内鼻内 灌胃灌胃毒力检测毒力检测o半数致死量半数致死量 LD50o半数感染量半数感染量 ID50二、检测病原菌成分二、检测病原菌成分p抗原的检测抗原的检测p核酸的检测核酸的检测（一）抗原的检测（一）抗原的检测o利用已知的特异性Ab检测Ag的方法
7、o常用的方法有n玻片凝集n协同凝集试验nELISAn免疫荧光法ELISA（二）核酸检测方法（二）核酸检测方法o聚合酶链反应（PCR）o核酸杂交技术nSouthern blotnNorthern blotnDot blotnIn situ hybridizationo基因芯片(Gene chip)o16S rRNA16sRNA基因序列分析基因序列分析o只存在于原核细胞型微生物的染色体基因中o16sRNA，23sRNA,5sRNAo可变区和保守区n保守区：所有的细菌所共有n可变区：属和种的特异性PCRGene Chip三、抗体的检测三、抗体的检测o用已知细菌或其Ag检测相应的特异性Ab及其量的多少
8、，作为某些病原菌感染的辅助诊断o急性期和恢复期双份血清，恢复期效价升高4倍有诊断价值o方法方法n玻片或试管凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、 冷凝集试验、ELISAp局限局限n难以早期诊断第二节第二节 病毒感染的微生物学检查法病毒感染的微生物学检查法o形态学形态学o病毒的分离鉴定病毒的分离鉴定n在培养细胞中增殖的鉴定指标在培养细胞中增殖的鉴定指标o病毒成分的检测病毒成分的检测o病毒抗体的检测病毒抗体的检测（一）病毒的形态学检查（一）病毒的形态学检查 o电子显微镜电子显微镜（ EM） n免疫电镜, IEMo光学显微镜（光学显微镜（CM）n包涵体o内基小体（Negri body）HAVNegri
9、body动物接种：动物模型动物接种：动物模型鸡胚接种：鸡胚接种：914d组织培养组织培养器官培养组织培养 细胞培养 原代细胞培养二倍体细胞培养传代细胞培养三三大大培培养养方方法法（二）病毒的分离培养的方法（二）病毒的分离培养的方法血凝抑制实验血凝抑制实验中和实验中和实验PCR检测检测病毒分离培养及鉴病毒分离培养及鉴o细胞病变（细胞病变（cytopathy) o红细胞吸附红细胞吸附 (hemadsorption)o病毒干扰作用病毒干扰作用 (viral interference)o中和试验中和试验 (neutralization test, NT)o空斑形成试验空斑形成试验 (plaque fo
10、rmation)病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标细胞病变细胞病变细胞病变效应细胞病变效应（CPE） 细胞病变效应（细胞病变效应（CPECPE）A：未感染病毒的HeLa细胞；B：被柯萨奇病毒B3感染后，细胞变圆、皱缩，细胞折光性减弱；C：被腺病毒感染后，细胞肿胀，折光性增强，呈葡萄状排列。200 n50%50%50%50%组织细胞感染量组织细胞感染量组织细胞感染量组织细胞感染量 TCID50:TCID50:TCID50:TCID50:n n根据有无细胞病变来判断病毒感染性和毒力的指标根据有无细胞病变来判断病毒感染性和毒力的指标根据有无细胞病变来判断病毒感染性和毒力的指
11、标根据有无细胞病变来判断病毒感染性和毒力的指标 o细胞病变o红细胞吸附：血凝素（HA）o病毒干扰作用o中和试验o病毒数量及感染性的检测n空斑形成试验n红细胞凝集红细胞吸附红细胞吸附病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标plaque空斑形成试验空斑形成试验n用于病毒浓度的精确定量和测定抗病毒药物的作用n一个空斑是由一个病毒大量复制而成，称为空斑形成单位（Plaque forming unit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示（三）病毒成分的检测（三）病毒成分的检测o病毒抗原的检测病毒抗原的检测: : ELISA o病毒核酸的检测病毒核酸的检测 核酸杂交、PCR、 基
12、因芯片病毒成分的检测病毒成分的检测（四）病毒抗体的检测（四）病毒抗体的检测o中和试验（NT）o血凝抑制试验（HT）o补体结合试验（CF）oELISA法o蛋白印迹技术小小 结结o细菌感染的微生物学检查法细菌感染的微生物学检查法n病原体检查n核酸的检测n抗原、抗体的检测o病毒感染的微生物学检查法病毒感染的微生物学检查法n电镜及免疫电镜n病毒的分离培养和鉴定n核酸的检测n抗原、抗体的检测小结小结o抗细菌免疫n固有免疫n获得性免疫o抗病毒免疫n固有免疫干扰素n获得性免疫问问 题题o采集标本的原则？采集标本的原则？o病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标？病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标？o干扰素的概念及其抗病毒机制干扰素的概念及其抗病毒机制自检内容自检内容1. 机体抗结核分枝杆菌的感染免疫主要依赖A.屏障结构 B.细胞免疫 C.抗体的中和作用D.非特异性免疫分子 E.吞噬细胞的吞噬作用2. 灭活和清除游离病毒主要依靠A.干扰素 B.抗体 C.细胞因子 D.非特异性免疫分子 E.皮肤粘膜屏障自检内容自检内容3.抑制病毒的增殖，保护邻近细胞免疫受病毒感染的抗病毒作用机制是 A.抗体 B.NK细胞 C.细胞因子D.干扰素 E.CRP4.伤寒病人，病程有5天左右，应采集的标本是A.血液 B.粪便 C.尿液 D.咽部 E.脓液
