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1、DNA甲基化的作用(zuyng)CpGCpG占基因组的占基因组的1010，其中，其中70708080为甲基化。为甲基化。未甲基化的未甲基化的CpGCpG岛处于组成性表达基因启动子的周围；也岛处于组成性表达基因启动子的周围；也存在于一些组织特异性基因的启动子周围存在于一些组织特异性基因的启动子周围CpGCpG岛的甲基化改变了染色质结构，造成高度螺旋化，失岛的甲基化改变了染色质结构，造成高度螺旋化，失去了去了DNaseDNase敏感性，阻止了启动子的活化，同时能够与甲敏感性，阻止了启动子的活化，同时能够与甲基化基化CpGCpG结合蛋白质结合，如组蛋白去乙酰化酶等，可以结合蛋白质结合，如组蛋白去乙酰
2、化酶等，可以抑制基因的表达。抑制基因的表达。甲基化甲基化DNA DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子可直接作用于甲基化敏感转录因子E2FE2F、CREBCREB、A P2A P2、NF2KBNF2KB、CmybCmyb、EtsEts使其失去结合使其失去结合DNADNA的功能，阻断的功能，阻断转录转录甲基化甲基化CPG CPG 粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子(SP1(SP1、CTFCTF、YY1) , YY1) , 使它们失活使它们失活, , 从而从而(cng r)(cng r)阻断转录。阻断转录。5 5 种带有甲基化种带有甲基化DNA DNA 结合域
3、结合域(MBD ) (MBD ) 的甲基化的甲基化CpG CpG 粘附蛋白粘附蛋白(MECP2(MECP2、MBD1MBD1、MBD2MBD2、MBD3MBD3；MBD1 )MBD1 )有糖基转移酶活性有糖基转移酶活性, , 可将可将T T 从错配碱基对从错配碱基对T TG G 中移去。中移去。第1页/共19页第一页，共20页。用组蛋白Hl与含CCGG序列的甲基化和非甲基化DNA实验后发现：甲基化达到一定(ydng)程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。又由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。DNA甲基化导致某些区域DNA构
4、象变化，影响蛋白质与DNA的相互作用；抑制转录因子与启动区DNA的结合效率。用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料，比较其作为RNA聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了其体外转录活性。5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是随机分布的，基因的5端和3端往往富含甲基化位点，而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关.第2页/共19页第二页，共20页。组织培养的细胞由于组织培养的细胞由于(yuy)(yuy)甲基化作用，使细胞系不能表达出相应的组织特异甲基化作用，使细胞系不能表达出相应的组织特异性蛋白质。性蛋白质。 20062006年制备了拟南芥的全
5、基因组甲基化图谱，发现转录区域年制备了拟南芥的全基因组甲基化图谱，发现转录区域1/31/3以上的表达区域以上的表达区域出现了甲基化；而启动子区有少于出现了甲基化；而启动子区有少于5 5的基因出现了甲基化；在转录区域的甲基的基因出现了甲基化；在转录区域的甲基化表现出了明显的组织特异性。化表现出了明显的组织特异性。甲基化通常发生于外源序列中，使其处于异染色质状态，是寄主抵御外源序列入甲基化通常发生于外源序列中，使其处于异染色质状态，是寄主抵御外源序列入侵的策略，是侵的策略，是1 1种主动防御机制。种主动防御机制。第3页/共19页第三页，共20页。DNA甲基化形成(xngchng)过程在DNA甲基化
6、过程中，胞嘧啶DNA双螺旋突出进入与酶结合部位的裂隙，通过胞嘧啶甲基转移酶把活性甲基从甲硫氨酸转移至5胞嘧啶位上，形成5甲基胞嘧啶。2类甲基转移酶：维持(wich)甲基化的DNA甲基转移酶Dnmtl：使复制后形成的半甲基化DNA进行全甲基化；获得与亲本DNA完全相同的甲基化形式。S期：Dnmt1与其相关蛋白DMAP1共同定位于复制叉处重新甲基化的DNA甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b：在没有甲基化的DNA双链上进行甲基化在不同的细胞周期其位置会发生改变，如小鼠成纤维细胞中Dnmt3a、异染色质蛋白HP1以及甲基化DNA结合蛋白MeCP2都定位于复制晚期的异染色质着丝粒周围，而Dnmt3b则
7、普遍存在于核内；在胚胎干细胞中，Dnmt3a、Dnmt3b和HP1则都定位于着丝粒周围。第4页/共19页第四页，共20页。CpGCpG甲基化形成机制：甲基化形成机制：甲基化酶：甲基化酶：DamDam甲基化酶：催化甲基化酶：催化GATCGATC中的中的A A甲基化（原核）甲基化（原核）DcmDcm甲基化酶：催化甲基化酶：催化CCGGCCGG中中2 2位位C C甲基化（原核，甲基化（原核，JM109,HB101JM109,HB101）真核生物甲基化酶：真核生物甲基化酶：CpGCpG的的C C形成形成55甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶维持甲基化酶（维持甲基化酶（maintenance DNA maintena
8、nce DNA methyltransferase) (dnmt1) :methyltransferase) (dnmt1) :在甲基化双链中在甲基化双链中只有亲代是甲基化的，而子代为非甲基化。此酶识只有亲代是甲基化的，而子代为非甲基化。此酶识别亲代甲基化位点，催化子代甲基化；对半甲基化别亲代甲基化位点，催化子代甲基化；对半甲基化的全甲基化催化效率非常高。一旦突变，导致全基的全甲基化催化效率非常高。一旦突变，导致全基因组去甲基化，引发胚胎因组去甲基化，引发胚胎(piti)(piti)死亡死亡重新甲基化酶（重新甲基化酶（de novo DNA de novo DNA methyltransfer
9、ase)methyltransferase)（dnmt3adnmt3a和和dnmt3b):dnmt3b):使没有使没有甲基化的双链发生甲基化；使早期胚胎甲基化的双链发生甲基化；使早期胚胎(piti)(piti)发发生重新甲基化；生重新甲基化；dnmt3bdnmt3b突变引发着丝粒不稳定，面突变引发着丝粒不稳定，面部畸形和致死性免疫缺陷。部畸形和致死性免疫缺陷。第5页/共19页第五页，共20页。甲基化与去甲基化甲基化与去甲基化去甲基化：去甲基化：被动途径被动途径: : 由于核因子由于核因子N F N F 粘附甲基化的粘附甲基化的DNA , DNA , 使粘附点使粘附点附近的附近的DNADNA不能
10、被完全甲基化不能被完全甲基化, , 从而阻断从而阻断DNM T1 DNM T1 的作用的作用; ; 主动主动(zhdng)(zhdng)途径途径: : 是由去甲基酶的作用是由去甲基酶的作用, , 将甲基集团移将甲基集团移去。去。甲基化与去甲基化的动态变化：甲基化与去甲基化的动态变化：囊胚期达到去甲基化极点，着床后再甲基化；囊胚期达到去甲基化极点，着床后再甲基化；雄原核先去甲基化，雌原核在卵裂后去甲基化；雄原核先去甲基化，雌原核在卵裂后去甲基化；羊在原肠前不去甲基化，原肠期达到甲基化极点，分化过程羊在原肠前不去甲基化，原肠期达到甲基化极点，分化过程中才去甲基化。中才去甲基化。第6页/共19页第六
11、页，共20页。CpGCpG岛影响基因转录的机制岛影响基因转录的机制直接抑制转录复合物，如直接抑制转录复合物，如HATHAT（组蛋白乙酰化酶）、（组蛋白乙酰化酶）、CACA（辅助激活因子）、（辅助激活因子）、TFTF（基础转录因子）；对甲基（基础转录因子）；对甲基化敏感的化敏感的TFTF有：有：AP-2,E2F,NFkB;AP-2,E2F,NFkB;不敏感的有不敏感的有Sp1Sp1。基因表达时需要核小体松散、组蛋白乙酰化，这样可基因表达时需要核小体松散、组蛋白乙酰化，这样可以以(ky)(ky)吸引吸引HATHAT、CACA、TFTF等转录因子与等转录因子与DNADNA结合而结合而启动转录。但启动
12、转录。但CpGCpG甲基化后，结合甲基化后，结合5 5甲基胞嘧啶结合甲基胞嘧啶结合蛋白（如蛋白（如MBD1,MBD2,MBD3T,MBD4,Mecp2MBD1,MBD2,MBD3T,MBD4,Mecp2等，等，methylcytosine-binding domains),methylcytosine-binding domains),激发去乙酰化激发去乙酰化酶，组蛋白恢复正常，染色体结构改变而抑制基因表酶，组蛋白恢复正常，染色体结构改变而抑制基因表达。达。有些情况下，组蛋白出现去乙酰化，使得重新甲基化有些情况下，组蛋白出现去乙酰化，使得重新甲基化酶与酶与CpGCpG结合，引发染色体结构变化和
13、结合，引发染色体结构变化和CpGCpG甲基化，甲基化，抑制基因表达。抑制基因表达。第7页/共19页第七页，共20页。甲基化与基因甲基化与基因(jyn)(jyn)印记：印记：基因印记的概念：基因印记的概念：配子或合子在发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性加工修饰，导致后代体细配子或合子在发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性加工修饰，导致后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性。既依赖于亲本起源所引发等位基因表达不对称现象胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性。既依赖于亲本起源所引发等位基因表达不对称现象(xinxing)(xinxing)
14、。大部分印记基因都有差异甲基化区域大部分印记基因都有差异甲基化区域第8页/共19页第八页，共20页。CpGCpG甲基化的鉴定甲基化的鉴定(jindng)(jindng)免疫学法：标记可以免疫学法：标记可以(ky)(ky)特异性识别特异性识别5m5mC C的抗体，的抗体，测定荧光素强度（测定甲基化的含量）。测定荧光素强度（测定甲基化的含量）。Sss ISss I甲基转移酶：测定底物（甲基转移酶：测定底物（S-S-腺苷甲硫氨酸）剩腺苷甲硫氨酸）剩余量来推测甲基化程度（甲基化位点的含量）余量来推测甲基化程度（甲基化位点的含量）直接测序法：用亚硫酸氢钠将胞嘧啶转变成尿嘧啶，直接测序法：用亚硫酸氢钠将胞
15、嘧啶转变成尿嘧啶，通过对特定区域进行通过对特定区域进行PCRPCR后转变成后转变成T T，通过比对查找甲，通过比对查找甲基化位点基化位点酶切法：先酶切后扩增，切开了不能形成目的片段酶切法：先酶切后扩增，切开了不能形成目的片段第9页/共19页第九页，共20页。酶切消化(xiohu)法两种酶切方法可以(ky)鉴定DNA甲基化SmaI-XmaI(CCCGGG)，此序列在基因组内非常少。HpaII-MspI(CCGG)，较为常用。内切酶MspI可以(ky)切开是否甲基化的CCGG序列；内切酶HpaII对已经甲基化的CCGG序列不能切开，从而可以(ky)鉴定，是否甲基化。此方法的两个缺陷：并不是所有的C
16、pG均在CCGG序列中，会被低估要使用Southern杂交，比较繁琐第10页/共19页第十页，共20页。亚硫酸氢盐法利用亚硫酸氢盐将DNA中的胞嘧啶（C）转换成尿嘧啶（U）结合PCR反应变成胸腺嘧啶（T）过程：酶切消化DNA，将2gDNA溶于19ml水中转换液：107l4.04MNaHSO;3,7l10mM对苯二酚（Hydroquinone）和6l6NNaOH，总体积(tj)120l,pH5.00.将DNA溶液加入1l6NNaOH，37C培养15min加入120l转换液，95C变性30sec，转化处理50C转化处理15min，共计15个循环沉淀DNA用于后续反应.第11页/共19页第十一页，共
17、20页。甲基化特异性PCRMethylationSpecificPCRU转换引物设计两对，3端设计到检测点：一对检测甲基化链另一对检测非甲基化链放射性标记,检测甲基化敏感引物单核苷酸延伸U转换PCR扩增引物延伸标记引物末端(mdun)PCR片段有无检测第12页/共19页第十二页，共20页。COBRA方法(fngf)结合重亚硫酸氢盐的限制性内切酶法U转换(zhunhun)PCR酶切消化第13页/共19页第十三页，共20页。六、DNA的三级结构(jigu)鸟嘌呤之间的特异性相互作用造成鸟嘌呤之间的特异性相互作用造成G-G-四联体，四四联体，四个个G G有序地排列在一个正方形的片层中，相邻碱基有序地
18、排列在一个正方形的片层中，相邻碱基间以非正常的间以非正常的G-GG-G氢键连接，形成首尾相连氢键连接，形成首尾相连(shu (shu wi xing lin)wi xing lin)的环形结构，片层中间是由电的环形结构，片层中间是由电负性的羰基氧组成的口袋，可以容纳一个一价的负性的羰基氧组成的口袋，可以容纳一个一价的阳离子。阳离子。X X光衍射技术证明，多聚鸟苷酸形成四螺旋的光衍射技术证明，多聚鸟苷酸形成四螺旋的DNADNA结构，整个四链结构可以看成由多个结构，整个四链结构可以看成由多个G-G-四联体片四联体片层以螺旋形式堆积起来，分别来自四条多聚鸟苷层以螺旋形式堆积起来，分别来自四条多聚鸟苷
19、酸链。螺旋的扭角为酸链。螺旋的扭角为3030度、螺距度、螺距34A34A、G G糖苷键为糖苷键为反式结构、磷酸骨架采取平行的反式结构、磷酸骨架采取平行的5-35-3排列方式。排列方式。第14页/共19页第十四页，共20页。图解第15页/共19页第十五页，共20页。真核生物染色体的端粒中，有许多富含鸟嘌呤的串联重复序列：真核生物染色体的端粒中，有许多富含鸟嘌呤的串联重复序列：尖毛虫端粒：尖毛虫端粒：d d（TTTTTGGGGGTTTTTGGGGG）n n四膜虫端粒：四膜虫端粒： d d（TTGGGGTTGGGG）n n人类端粒：人类端粒： d d（TTAGGGTTAGGG）n n这些富含这些富含
20、G G序列总是位于端粒的序列总是位于端粒的33端、其端、其55端为富含端为富含C C的序列，因此端粒在一的序列，因此端粒在一定条件下可能采取定条件下可能采取(ciq)(ciq)与与PolyPoly（G G）类似的四联体结构。）类似的四联体结构。第16页/共19页第十六页，共20页。在端粒DNA中也发现了许多G-四联体(lint)的特征在非变性电泳中，端粒表现出很高的泳动性，表明具有很好的压缩状态；在非变性电泳中，端粒表现出很高的泳动性，表明具有很好的压缩状态；端粒端粒DNADNA特殊结构的形成也需要一价阳离子的存在；特殊结构的形成也需要一价阳离子的存在；在一定在一定(ydng)(ydng)条件
21、下，端粒条件下，端粒DNADNA表现出对单链核酸酶的抗性；表现出对单链核酸酶的抗性；核磁共振表明端粒中有核磁共振表明端粒中有G-GG-G氢键的形成。氢键的形成。第17页/共19页第十七页，共20页。端粒与PolyG相比又表现(bioxin)出新的特征串联重复串联重复(chngf)(chngf)的的G G相互配对形成相互配对形成G-G-四联体，将导致四联体，将导致DNADNA链的回链的回折，折，A-TA-T序列产生环状，缠绕在序列产生环状，缠绕在G-G-四联体的上下两端。由于回折，四联体的上下两端。由于回折，4 4条链的磷酸骨架出现反平行的条链的磷酸骨架出现反平行的5-35-3方向排列，从而产生
22、反常的顺方向排列，从而产生反常的顺式鸟嘌呤糖苷键。不同磷酸骨架的方向、顺反糖苷键在式鸟嘌呤糖苷键。不同磷酸骨架的方向、顺反糖苷键在G G四联体中的四联体中的分布、以及环的连接方式，都导致了多种结构异构体的产生。分布、以及环的连接方式，都导致了多种结构异构体的产生。除了端粒除了端粒DNADNA以外，其他富含以外，其他富含G G的的DNADNA序列也可能产生类似序列也可能产生类似PolyGPolyG的四的四联体结构。如免疫球蛋白铰链区基因中富含联体结构。如免疫球蛋白铰链区基因中富含G G的部位、的部位、tRNAtRNA等，任何等，任何成串的串联重复成串的串联重复(chngf)G(chngf)G均可形成这种特殊结构。均可形成这种特殊结构。第18页/共19页第十八页，共20页。感谢您的欣赏(xnshng)！第19页/共19页第十九页，共20页。内容(nirng)总结DNA甲基化的作用。CpG占基因组的10，其中7080为甲基化。组织培养的细胞由于甲基化作用，使细胞系不能表达出相应的组织特异性蛋白质。对甲基化敏感的TF有：AP-2,E2F,NFkB。免疫学法：标记可以特异性识别5mC的抗体，测定荧光素强度（测定甲基化的含量）。引物延伸标记引物末端。真核生物染色体的端粒中，有许多富含鸟嘌呤的串联重复序列(xli)：。感谢您的欣赏第二十页，共20页。
