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1、急性肾功能衰竭急性肾功能衰竭及药物的影响及药物的影响P137 1. 1. 复制兔急性中毒性肾功能衰竭模型。复制兔急性中毒性肾功能衰竭模型。 2. 2. 肾功能指标检测及肾脏形态学肾功能指标检测及肾脏形态学 3. 3. 观察药物对急性肾衰的治疗效果观察药物对急性肾衰的治疗效果 4. 4. 分析急性肾衰的发病机制。分析急性肾衰的发病机制。【实验目的实验目的】【实验原理实验原理】 造模，提前造模，提前24hr，给兔皮下注射给兔皮下注射0.3-0.4% HgCL2 1ml/kg，造成造成ARF模型。模型。 【实验方法和步骤实验方法和步骤】处死家兔处死家兔处死家兔处死家兔, , 取一肾观察大体取一肾观察
2、大体取一肾观察大体取一肾观察大体( (称重，形状，颜色，称重，形状，颜色，称重，形状，颜色，称重，形状，颜色，纵向剖开观察皮髓质条纹色泽纵向剖开观察皮髓质条纹色泽纵向剖开观察皮髓质条纹色泽纵向剖开观察皮髓质条纹色泽) )实验步骤实验步骤家兔称重、麻醉、固定家兔称重、麻醉、固定家兔称重、麻醉、固定家兔称重、麻醉、固定分离左颈总动脉、穿两线、远心结扎、近心分离左颈总动脉、穿两线、远心结扎、近心分离左颈总动脉、穿两线、远心结扎、近心分离左颈总动脉、穿两线、远心结扎、近心A A夹闭夹闭夹闭夹闭插管插管插管插管( (结扎结扎结扎结扎) )、放血、放血、放血、放血2ml2ml至至至至试管试管试管试管1 1
3、、近心结扎、近心结扎、近心结扎、近心结扎暴露膀胱暴露膀胱暴露膀胱暴露膀胱, ,注射器吸注射器吸注射器吸注射器吸2ml2ml尿液至尿液至尿液至尿液至试管试管试管试管3 3膀胱插管膀胱插管膀胱插管膀胱插管( (先充满先充满先充满先充满NS)NS)尿常规尿常规尿常规尿常规: : WBC,WBC,管型管型管型管型蛋白蛋白蛋白蛋白- -磺柳酸磺柳酸磺柳酸磺柳酸不充盈肝素不充盈肝素不充盈肝素不充盈肝素, ,用以取血用以取血用以取血用以取血血液静置血液静置血液静置血液静置10min,3000r/min10min,3000r/min离心离心离心离心10min,10min,上清至上清至上清至上清至试管试管试管试
4、管2 2耳缘耳缘耳缘耳缘iV.DAiV.DA, ,速尿速尿速尿速尿尿量观察尿量观察尿量观察尿量观察( 5min( 5min内内内内) )肌酐测定：肌酐测定：肌酐测定：肌酐测定：血清血清血清血清100100 l l + +比色液比色液比色液比色液2ml2ml 实验性治疗对尿量的影响实验性治疗对尿量的影响 (1) 记录记录5min尿量。尿量。 (2) 快速快速iv注射注射 NS 20ml，记录记录5min尿量。尿量。 (3) iv多巴胺多巴胺20g/Kg（0.1ml/Kg），记录，记录5min尿量。尿量。 (4) iv速尿速尿5mg/kg，记录记录5min尿量。尿量。 肾形态学观察肾形态学观察 耳
5、静脉注射耳静脉注射10ml空气处死家兔，空气处死家兔， 取出肾脏称重，计算肾取出肾脏称重，计算肾/体重比。体重比。 观察肾脏外形，色泽。观察肾脏外形，色泽。 纵向剖开，观察皮髓质条纹，色泽。纵向剖开，观察皮髓质条纹，色泽。注意事项注意事项1.家兔实验前多喂水和蔬菜，以保证有尿家兔实验前多喂水和蔬菜，以保证有尿2.保护耳缘静脉，需多次注射。保护耳缘静脉，需多次注射。汞毒性机制可大致概括为三点汞毒性机制可大致概括为三点1、酶抑制作用。、酶抑制作用。2、激活、激活Ca2介导反应。介导反应。3、免疫致病性。、免疫致病性。主要累及肾小管近曲小管主要累及肾小管近曲小管肾小管阻塞及原尿反流示意图 血肌酐血肌
6、酐 尿蛋白尿蛋白 尿管型尿管型/白细胞白细胞 利尿尿量利尿尿量 肾形态肾形态急性肾功能衰竭各项指标的变化急性肾功能衰竭各项指标的变化正常正常ARF1，结果描述/理论值及失败原因分析2，解释现象 急性汞中毒多用二巯基丙醇磺酸钠(DMPS)肌内注射，每日12次或二巯基丁二酸钠(DMS)静脉注射，每日一次,可持续57日，视病情而定。但若患者出现急性肾功能衰竭，则驱汞应暂缓，而以肾衰抢救为主；或在血液透析配合下作小剂量驱汞治疗。 膀胱插管注意事项腹部切口位置：耻骨联合上正中，长4cm找到输尿管，在其下方穿线结扎膀胱口膀胱切口：血管最少处，膀胱插管内充满生理盐水汞毒性机制可大致概括为三点1、酶抑制作用。
7、汞对于酶的各种活性基团如氨基羧基羟基磷 酰基特别是巯基有高度亲和力可与之结合使酶失活2、激活Ca2介导反应。如磷脂水解过程激活后可使花生四烯酸血栓素氧自由基等大量生成造成组织损伤3、免疫致病性。汞可引起免疫性肾小球损伤. 汞离子易与巯基结合，使与巯基有关的细胞色素氧化酶、丙酮酸激酶、琥珀酸脱氢酶等失去活性。汞还与氨基、羧基、磷酰基结合而影响功能基团的活性。由于这些酶和功能基团的活性受影响，阻碍了细胞生物活性和正常代谢，最终导致细胞变性和坏死。近年来，发现汞对肾脏损害，以肾近曲小管上皮细胞为主。 HgClHgCl2 2主要损伤肾脏的肾小管细胞主要损伤肾脏的肾小管细胞主要损伤肾脏的肾小管细胞主要损
8、伤肾脏的肾小管细胞 少尿或无尿；少尿或无尿；少尿或无尿；少尿或无尿； 尿中有管型、白细胞、蛋白质及红细胞尿中有管型、白细胞、蛋白质及红细胞尿中有管型、白细胞、蛋白质及红细胞尿中有管型、白细胞、蛋白质及红细胞等；等；等；等； 氮质血症氮质血症氮质血症氮质血症：血、尿中肌酐等升高；：血、尿中肌酐等升高；：血、尿中肌酐等升高；：血、尿中肌酐等升高；【实验原理实验原理】肾脏内部的结构，可分为肾实质和肾盂两部分。肾脏内部的结构，可分为肾实质和肾盂两部分。 在肾纵切面可以看到，肾实质分内外两层：外层为皮质，内层为髓在肾纵切面可以看到，肾实质分内外两层：外层为皮质，内层为髓质。质。 肾皮质新鲜时呈淡红色肾皮
9、质新鲜时呈淡红色,由一百多万个由一百多万个肾单位肾单位组成。每个肾单位由组成。每个肾单位由肾小球、肾小囊和肾小球、肾小囊和肾小管肾小管所构成，部分皮质伸展至髓质锥体间，成为肾所构成，部分皮质伸展至髓质锥体间，成为肾柱。柱。 肾髓质肾髓质新鲜时呈红褐色，为新鲜时呈红褐色，为10-20个锥体所构成。肾锥体在切面上个锥体所构成。肾锥体在切面上呈三角形。锥体底部向肾凸面，尖端向肾门，锥体主要组织为集合管，呈三角形。锥体底部向肾凸面，尖端向肾门，锥体主要组织为集合管，锥体尖端称肾锥体尖端称肾乳头乳头，每一个乳头有，每一个乳头有10-20个乳头管，向肾小盏漏斗部开个乳头管，向肾小盏漏斗部开口。口。 在肾窦
10、内有肾小盏，为漏斗形的膜状小管，围绕肾乳头。肾椎体与在肾窦内有肾小盏，为漏斗形的膜状小管，围绕肾乳头。肾椎体与肾小盏相连接。每肾有肾小盏相连接。每肾有78个肾小盏，相邻个肾小盏，相邻23个肾小盏合成一个肾大个肾小盏合成一个肾大盏。每肾有盏。每肾有23个肾大盏，肾大盏汇合成扁漏斗状的肾盂。肾孟出肾门个肾大盏，肾大盏汇合成扁漏斗状的肾盂。肾孟出肾门后逐渐缩窄变细，移行为输尿管。后逐渐缩窄变细，移行为输尿管。 肾单位是肾脏结构和功能的基本单位。肾单位是肾脏结构和功能的基本单位。 每个肾单位由每个肾单位由肾小体肾小体和肾小管组成。和肾小管组成。 肾小体内有一个肾小体内有一个毛细血管毛细血管团，称为肾小
11、球，肾小球是个血管球。它团，称为肾小球，肾小球是个血管球。它由肾动脉分支形成。肾小球外有由肾动脉分支形成。肾小球外有肾小囊肾小囊包绕。肾小囊分两层，两层之间包绕。肾小囊分两层，两层之间有囊腔与肾小管的管腔相通。有囊腔与肾小管的管腔相通。 肾小管汇成集合管。若干集合管汇合成乳头管，尿液由此流入肾小肾小管汇成集合管。若干集合管汇合成乳头管，尿液由此流入肾小盏。盏。 Hg2+由于具有高度的亲电子性，因此对体内硫基、羧基、氨基等由于具有高度的亲电子性，因此对体内硫基、羧基、氨基等供电子基团具很强的攻击力。而这些基团又是机体内重要的活性基供电子基团具很强的攻击力。而这些基团又是机体内重要的活性基团，团，
12、Hg2+与它们结合后对机体的正常生理生化功能产生巨大影响。与它们结合后对机体的正常生理生化功能产生巨大影响。特别是对硫基有高度亲合力，这也是汞的毒性机制的核心，因为硫特别是对硫基有高度亲合力，这也是汞的毒性机制的核心，因为硫基不仅是氧化还原酶类、转移酶类最重要的功能基团，也是膜结构基不仅是氧化还原酶类、转移酶类最重要的功能基团，也是膜结构蛋白中最主要基团，是许多受体结构的重要成分，且处于膜结构的蛋白中最主要基团，是许多受体结构的重要成分，且处于膜结构的最表层，最易受到攻击。如汞化合物能引起抗氧化酶（锰超氧化物最表层，最易受到攻击。如汞化合物能引起抗氧化酶（锰超氧化物歧化酶）异常，且抗氧化酶活力
13、的降低与组织内歧化酶）异常，且抗氧化酶活力的降低与组织内Hg2+浓度呈正比浓度呈正比78。研究表明脂质过氧化反应可能是肾毒性化合物诱导的急性肾。研究表明脂质过氧化反应可能是肾毒性化合物诱导的急性肾损伤的毒力学发病机制。损伤的毒力学发病机制。Hg2+除与酶、结构蛋白等大分子物质发生共价结合，造成功能和除与酶、结构蛋白等大分子物质发生共价结合，造成功能和结构损伤外，它的亲电子性还决定它对结构损伤外，它的亲电子性还决定它对DNA也有明显攻击性，可造也有明显攻击性，可造成成DNA单链簖裂，但没有资料表明汞的遗传性。单链簖裂，但没有资料表明汞的遗传性。Hg2+导致细胞外液导致细胞外液Ca2+大量进入细胞
14、，引起大量进入细胞，引起“钙超载钙超载”，并且还，并且还可以激活可以激活Ca2+的反应位点，直接诱发的反应位点，直接诱发Ca2+介导的各种反应，促进介导的各种反应，促进细胞损伤。细胞损伤。20HgCl2诱导的鼠诱导的鼠ARF中密致斑细胞和肾毛细血管球上皮细胞内的脑中密致斑细胞和肾毛细血管球上皮细胞内的脑一氧化氮合成酶（一氧化氮合成酶（bNOS）表达降低，使得具有舒血管作用的）表达降低，使得具有舒血管作用的NO在在肾血管球浓度降低，而其它收血管因子增加导致血管强烈收缩、组肾血管球浓度降低，而其它收血管因子增加导致血管强烈收缩、组织缺血缺氧加重肾损伤织缺血缺氧加重肾损伤79。此外此外HgCl2引起
15、的肾代谢的紊乱及缺氧使得表皮生长因子（引起的肾代谢的紊乱及缺氧使得表皮生长因子（EGF）和胰岛素样生长因子（和胰岛素样生长因子（IGF1）表达显著降低，阻止肾细胞的损伤）表达显著降低，阻止肾细胞的损伤修复。修复。ARF 兔尿肾功能生化指标的变化分析兔尿肾功能生化指标的变化分析正常尿中有少量蛋白存在，当肾小球及肾小管均受到损害正常尿中有少量蛋白存在，当肾小球及肾小管均受到损害时时,会有不同的蛋白在尿液中出现，反应肾脏的不同部位会有不同的蛋白在尿液中出现，反应肾脏的不同部位的损伤程度。的损伤程度。ARF 兔尿常规生化指标的变化分析兔尿常规生化指标的变化分析由于氯化汞诱发肾脏近曲小管的急性变性坏死，
16、引起肾小由于氯化汞诱发肾脏近曲小管的急性变性坏死，引起肾小管的重吸收原尿中的蛋白能力减弱或丧失；肾小管内坏死管的重吸收原尿中的蛋白能力减弱或丧失；肾小管内坏死脱落的小管上皮细胞释放出崩解产物大量存在于管腔中，脱落的小管上皮细胞释放出崩解产物大量存在于管腔中，这些蛋白成分与原尿中的血浆蛋白一起排出体外进一步加这些蛋白成分与原尿中的血浆蛋白一起排出体外进一步加剧了蛋白尿的形成。剧了蛋白尿的形成。由于肾性毒物在肾脏内的蓄积，引起肾小管上皮细胞的广由于肾性毒物在肾脏内的蓄积，引起肾小管上皮细胞的广泛坏死甚至是基底膜的断裂；随着毒物浓度在肾脏内的加泛坏死甚至是基底膜的断裂；随着毒物浓度在肾脏内的加大，不仅肾小管的损伤严重，肾小球毛细血管内皮细胞也大，不仅肾小管的损伤严重，肾小球毛细血管内皮细胞也见坏死脱落，血细胞出现在肾小囊腔内，这一系列的变化见坏死脱落，血细胞出现在肾小囊腔内，这一系列的变化最终形成了最终形成了ARF。、组尿常规检查时尿潜血（组尿常规检查时尿潜血（BLD）、）、尿蛋白（尿蛋白（PRO）两项指标与正常组比较差异显著（）两项指标与正常组比较差异显著（P 0.05 或或P 0.01）。）。尿中出尿中出现大量大量肾小管上皮小管上皮细胞及胞及颗粒管型，可粒管型，可见红细胞及胞及蛋白，但量不大；蛋白，但量不大；
