基因工程载体1

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1、第二章第二章 基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introductionintroduction）第一节第一节 质粒载体（质粒载体（plasimidvectorsplasimidvectors）第二节第二节 噬菌体载体（噬菌体载体（phagevectorsphagevectors）基因工程载体1第二章第二章 基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introductionintroduction）第一节第一节 质粒载体（质粒载体（plasmidvectorsplasmidvectors）第二节第二节 噬菌体载体（噬菌体载体（phagevectorsphagevectors）基因工程载

2、体1质粒载体的生物学特征质粒载体的生物学特征（1 1）质粒是质粒是一种广泛存在于细菌细胞中一种广泛存在于细菌细胞中染色体以外染色体以外的能的能自主的自主的复制复制的裸露的的裸露的环状双链环状双链DNADNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。（2 2）质粒的大小质粒的大小差异很大差异很大，最小的只有最小的只有1kb,1kb,只能编码中等大只能编码中等大小的小的2-32-3种蛋白质分子，

3、最大的达到种蛋白质分子，最大的达到200kb200kb。质粒的拷贝数多则。质粒的拷贝数多则5050，少则只有一个。少则只有一个。基因工程载体1（3 3）质粒的不亲和性，质粒的不亲和性，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存，属于同一个不亲和群，如同一宿主细胞中稳定共存，属于同一个不亲和群，如pMB1pMB1或或ColE1ColE1的派生质粒。已鉴别出的派生质粒。已鉴别出2525个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们是个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们是不不相容相容群体的。群体的。（4 4）质粒的分类质粒的分类 F F质粒，质粒，或叫致育质粒，仅携带转

4、移基因，特征：促进质粒或叫致育质粒，仅携带转移基因，特征：促进质粒间的有性结合。间的有性结合。 R R质粒，质粒，或叫耐药性质粒，能赋予宿主细胞耐药性，特征：或叫耐药性质粒，能赋予宿主细胞耐药性，特征：耐药性。耐药性。 Ti Ti质粒质粒, ,根瘤农杆菌中的毒性质粒，赋予宿主细胞致病性。根瘤农杆菌中的毒性质粒，赋予宿主细胞致病性。 Col Col 质粒，质粒， 降解质粒，降解质粒，质粒载体的生物学特征质粒载体的生物学特征基因工程载体1（5 5）质粒的存在形式质粒的存在形式 有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒种。在琼脂

5、糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNADNA，尽管分子，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移率。其中走在最前面的是量相同，仍具有不同的电泳迁移率。其中走在最前面的是SC DNA，其后依次是，其后依次是L DNA和和OC DNA。双螺旋共价闭合环双螺旋共价闭合环（超螺旋（超螺旋SCSC构型）构型）开环双螺旋（一个开环双螺旋（一个裂口，裂口， OCOC构型构型）线状双螺旋（两线状双螺旋（两个裂口，个裂口，L L构型）构型）质粒载体的生物学特征质粒载体的生物学特征基因工程载体1（1 1）pUCpUC是在是在pBR322pBR322基础基础上发展起来的克隆上发展起来的克隆载体。载体。大小为大小为2.

6、72.7kbkb，带有复制起始，带有复制起始位点，位点，ampicillinampicillin抗性基因和抗性基因和lacZlacZ 基基因。因。常用质粒载体介绍常用质粒载体介绍基因工程载体1（2 2）pGEM-3ZpGEM-3Z 带有带有 LacZLacZ 基因，大小为基因，大小为2.9kb2.9kb，氨苄青霉素抗性基因，高拷贝。氨苄青霉素抗性基因，高拷贝。基因工程载体1（3 3）pBluescriptSKpBluescriptSK pBluescriptSKpBluescriptSK同同pGEMpGEM类类似，另外还带有线状噬菌体似，另外还带有线状噬菌体f1f1的复制起始位点。的复制起始位

7、点。 可以产可以产生单链生单链DNADNA。基因工程载体1第二章第二章 基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introductionintroduction）第一节第一节 质粒载体（质粒载体（plasimidvectorsplasimidvectors）第二节第二节 噬菌体载体（噬菌体载体（phagevectorsphagevectors）基因工程载体1第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体一、一、 噬菌体噬菌体 1 1 噬菌体的生物学特征噬菌体的生物学特征 22 噬菌体的侵染噬菌体的侵染33 噬菌体的噬菌体的DNADNA分子分子二、二、M13M13噬菌体噬菌体基因工程载体1 噬菌体的生物学

8、特性噬菌体的生物学特性 噬噬菌菌体体由由正正二二十十面面体体的的蛋蛋白白质质头头部部和和中中空空管管状状的的蛋蛋白白质质尾尾部部组组成成。头头部部包包含含线线状状染染色色体体DNADNA，侵侵染染寄寄主主时时将将自自己己的的DNADNA注注入入寄寄主主细细菌菌。 噬噬菌菌体体属属温温和和噬噬菌菌体。体。基因工程载体1 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性TheThe PhagePhage consistconsistofofa alinearlinearchromosomechromosomeenclosedenclosedinina aproteinproteincoatcoat(capsi

9、d,(capsid,衣衣 壳壳 ). ).WhenWhen thethe phagephageinfectinginfectingthethehosthostcells,cells, it it injectsinjects itsitsDNADNAintointothethehosthostbacterium.bacterium.基因工程载体1 噬菌体的侵染噬菌体的侵染 噬菌体的侵染是噬菌体的侵染是溶源侵染，溶源侵染，是噬菌体是噬菌体DNADNA分子在宿分子在宿主细胞中能够稳定存在，许多主细胞中能够稳定存在，许多噬菌体噬菌体DNADNA能能整合到寄主细整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞

10、的分裂而进行复制。胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。 在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNADNA被称为被称为原噬菌体原噬菌体（prophageprophage ）。而携带了。而携带了原噬菌体原噬菌体的细的细菌被称为菌被称为溶源菌溶源菌（lysogenlysogen） 。基因工程载体1 噬噬菌菌体体的的侵侵染染基因工程载体1 噬菌体的侵染过程噬菌体的侵染过程LysogenicLysogenic cyclecycle ( (溶溶源源周周期期) )：UnderUnder certaincertain circumstances,circu

11、mstances,however,however, thethe lambdalambda DNADNA insertsinserts itselfitself intointo thetheE.E. colicolichromosomechromosome andand isis a a stablestable partpart ofof thethe chromosome.chromosome. TheTheLambdaDNAisreplicatedalongWithLambdaDNAisreplicatedalongWiththetheE.coliE.colichromosome.ch

12、romosome.If If thethe hosthostcellcell becomesbecomesdamaged,damaged,suchsuch asas UVUVtreatment,treatment,thetheprophageprophageDNADNA excisesexcisesitselfitselfandand undergoesundergoeslyticgrowth.lyticgrowth.基因工程载体1 噬菌体的噬菌体的DNADNA分子分子 DNADNA的的分分子子为为49kb,49kb,大大多多数数基基因因已已经经测测序序和和定定位位。至至少少包包括括6161个

13、个基基因因，其其中中一一部部分分为为噬噬菌菌体体生生命命活活动动的的必必须须基基因因，另另一一部部分分（b2b2区区）可可以以被被外外源源基基因因取取代代而而不不会影响到噬菌体的正常功能。会影响到噬菌体的正常功能。基因工程载体1 噬菌体的噬菌体的DNADNA分子分子 DNADNA在在分分子子两两端端各各有有1212个个碱碱基基的的单单链链互互补补粘粘性性末末端端。当当其其注注入入到到寄寄主主细细胞胞中中后后，可可以以迅迅速速通通过过这这两两个个粘粘性性末末端端的的互互补补作作用用形形成成双双链链的的环环形形DNADNA分分子子。上上述述通通过过粘粘性性末末端端互互补补形形成成的的双双链链区区被

14、被称称为为coscos位位点点（cohesive cohesive end siteend site）. .另外的作用是内切核酸酶的识别序列。另外的作用是内切核酸酶的识别序列。基因工程载体1第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体一、一、 噬菌体噬菌体二、二、M13M13噬菌体噬菌体 1 M131 M13噬菌体的生物学特征噬菌体的生物学特征 2 M132 M13噬菌体的侵染噬菌体的侵染 3 M13 3 M13噬菌体的载体噬菌体的载体基因工程载体11.M131.M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 M13M13是是线线状状的的大大肠肠杆杆菌菌噬噬菌菌体体，颗颗粒粒内内含含有有6 6 047bp0

15、47bp的的闭闭合合环环状状单单链链DNADNA基基因因组组，相相对对小小，意意味味着着可可供供插插入入的外源的外源DNA DNA 的空间小。的空间小。 M13M13单单链链DNADNA的的复复制制型型（RFRF，replicative replicative formform）是是呈呈双双链链环环形形，此此时时的的DNADNA，不不会会插插入入细细菌菌基基因因组组，持持续续复复制制，当当积积累累到到100-200100-200个个拷拷贝贝后后，噬噬菌菌体体DNADNA编编码码的的正正链链特特异异结结合合蛋蛋白白很很快快就就阻阻止止了了负负链链的的进进一一步步生生成成，但但以以负负链链为为模模

16、板板的的正正链链合合成成并并未未受受到到影影响响。大大量量游游离离的的正正链链DNADNA很快参入到外壳蛋白中形成了大量新的噬菌体颗粒。很快参入到外壳蛋白中形成了大量新的噬菌体颗粒。基因工程载体1M13M13噬噬菌菌体体的的侵侵染染基因工程载体1作为载体的优势作为载体的优势1 1 基因组小于基因组小于10 kb, 10 kb, 适合载体的要求。适合载体的要求。2 2 复制时其双链形式，可以像对质粒一样处理。复制时其双链形式，可以像对质粒一样处理。3 3 容易培养或转染，容易获得基因组。容易培养或转染，容易获得基因组。4 4 突突出出优优点点在在于于可可以以提提供供单单链链DNADNA，这这在在

17、DNA DNA 测测序序和和体体外突变中作用明显。外突变中作用明显。4 4 在在M13M13基基因因组组中中有有一一段段507bp507bp的的基基因因间间隔隔区区，该该区区可可以以接接受受外外源源DNADNA的的插插入入而而不不会会影影响响到到噬噬菌菌体体的的活活力力。这这是是该噬菌体能用于载体的重要前提。该噬菌体能用于载体的重要前提。3.M133.M13噬菌体载体噬菌体载体基因工程载体1 载载体体中中含含有有LacLacZ Z基基因因及及位位于于其其中中的的多多克克隆隆位位点点，所所以以能能通通过过 互互补补在在X-Gal/X-Gal/IPTGIPTG平平板板上上识识别别重重组组体体。这这类类载载体体包包括括了了 M13mp8M13mp8、9 9和和 M13mp18M13mp18、 1919等。等。 基因工程载体1基因工程载体1