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1、沈佐君沈佐君乙型肝炎患者抗病毒治疗乙型肝炎患者抗病毒治疗拉米夫定耐药性突变检测拉米夫定耐药性突变检测拉米夫定拉米夫定(Lamivudine)硫代脱氧胞嘧啶硫代脱氧胞嘧啶 （2-deoxy-3-thiacytidine，3TC）核苷类似物核苷类似物口服抗病毒药物口服抗病毒药物英英国国葛葛兰兰素素威威康康制制药药公公司司推推出出的的贺贺普普丁丁(heptodin) 在在2000年年已已被被国国家家药药品品监监督督管管理理局局批批准准列列入入国国家家基基本本药药物物制制剂剂品品种种目目录录，1998年被年被FDA批准用于临床。批准用于临床。拉米夫定的作用拉米夫定的作用降低降低HBVDNA的浓度的浓度
2、改善肝脏组织的病变改善肝脏组织的病变可可能能阻阻断断肝肝纤纤维维化化的的进进程程，终终止止肝肝硬硬化化的发展的发展不不受受人人种种、病病毒毒感感染染的的模模式式、野野生生型型或或基因组前基因组前C区突变的影响区突变的影响口服，副作用小口服，副作用小抗病毒机制抗病毒机制竞竞争争性性阻阻断断逆逆转转录录酶酶（依依赖赖RNA的的DNA多聚酶）活性，有效地抑制多聚酶）活性，有效地抑制HBV的复制的复制进进入入细细胞胞的的拉拉米米夫夫定定在在激激酶酶的的作作用用下下可可被被磷磷酸酸化化为为三三磷磷酸酸脱脱氧氧胞胞苷苷，可可以以与与dCTP竞竞争争性性掺掺入入延延伸伸的的DNA，因因它它缺缺乏乏3羟基而使
3、复制的病毒羟基而使复制的病毒DNA链终止。链终止。为什么在使用为什么在使用拉米夫定拉米夫定( (LamivudineLamivudine) )要进行要进行YMDDYMDD检测检测?拉米夫定治疗拉米夫定治疗HBV感染感染治疗过程与治疗过程与YMDD变异关系变异关系引自引自JVirol.Metods1999；83：181-187治疗过程治疗过程研究例研究例数数（例）例）无无变异变异（YMDD）变异变异 YVDD、YIDD 治疗前治疗前139106（76%）33（24%） 20(15%)13(9%) 治疗治疗9个月个月3733（89%）4（11%） 2(5.5%)、2(5.5%) 治疗治疗12个月个
4、月3725（67.5%）12（32.4%） 7(19%)、5(13.5%) 治疗治疗18个月个月167（43.7%）9（56.3%） 7(43.7%)、2(12.5%) 治疗治疗24个月个月124（33.3%）8（66.7%） 4(33.3%)、4(33.3%) YMDD变异的耐药机制变异的耐药机制第第552552位的蛋氨酸（位的蛋氨酸（M M）被缬氨酸（被缬氨酸（V V）或异亮氨酸（或异亮氨酸（I I）替代后，使此侧链缩替代后，使此侧链缩短，结合位点变大，不再适合拉米夫啶短，结合位点变大，不再适合拉米夫啶结合而导致耐药。结合而导致耐药。变异株对拉米夫啶的敏感性大大降低。变异株对拉米夫啶的敏感
5、性大大降低。体外实验证实该药物抑制变异株体外实验证实该药物抑制变异株HBVHBV复复制的效率可降为对野生株的万分之一。制的效率可降为对野生株的万分之一。 YMDD突变突变Met-ATGYMDDVal-GTGYVDDYVDDIle-ATTYIDD拉米夫定治疗中的突变发生位点拉米夫定治疗中的突变发生位点YMDD编码DNA多聚酶（CODON552）YMDD 野生株：野生株：Tyrosine - Methionine - Aspartate - Aspartate（YMDD）（）（ 酪氨酸酪氨酸 ） - （蛋氨酸（蛋氨酸 ） - （ 天门氡氨酸）天门氡氨酸）-（ 天门氡氨天门氡氨酸酸 ） 变异株变异株
6、1：Tyrosine - Valine -Aspartate - Aspartate（YVDD） （ 酪氨酸酪氨酸 ） - （缬氨酸（缬氨酸 ）- （ 天门氡氨酸）天门氡氨酸）-（ 天门氡氨酸天门氡氨酸 ） 变异株变异株2：Tyrosine - Isole-Aspartate - Aspartate （YIDD）（）（ 酪氨酸酪氨酸 ） - （异亮氨酸（异亮氨酸 ）- （ 天门氡氨酸）天门氡氨酸）-（ 天门氡氨天门氡氨酸酸 ）YMDD变异检测方法有：变异检测方法有：1、测序、测序：金标准，需昂贵仪器设备，成本高，过程复杂：金标准，需昂贵仪器设备，成本高，过程复杂2、基因芯片、基因芯片：技术目前
7、尚未成熟，仍需进一步研究：技术目前尚未成熟，仍需进一步研究3、限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性：目目前前临临床床用用得得最最多多的的是是RFLP，但但由由于于病病毒毒变变异异快快速速，即即使使有有轻轻微微的的碱碱基基变变化化，就就会会出出现现RFLP酶酶切切位位点点的的变变化化，出出现现新新的的酶酶切切位位点点或或原原有有的的酶酶切切位位点点消消失失，导导致致检检测测失失败败。而而且且RFLP完完全全依依靠靠凝凝胶胶电电泳泳来来判判断断结结果果，敏敏感感性性较较差差，假假阴阴性性率率较较高高。该该法法对对HBV混合型耐药株感染显得束手无策混合型耐药株感染显得束手无策4、荧荧光光定定量量
8、real-timePCR：该该技技术术为为核核酸酸的的检检测测提提供供了了新新的技术手段的技术手段YMDD突变检测常见方法1. 基因测序法（标准的参考方法）基因测序法（标准的参考方法）2. 荧光定量荧光定量PCR方法（实用的方法）方法（实用的方法）基基于于我我国国医医疗疗机机构构实实验验室室开开展展实实时时荧荧光光PCR检检测测十十分分普普遍遍，这这些些实实验验室室都都拥拥有有荧荧光光定定量量PCR分分析析仪仪。故故此此，建建立立了了一一种种新新的的适适应应这这类类设设备备的的实实时时荧荧光光PCR方方法法，应该符合中国的国情。应该符合中国的国情。荧光定量PCR检测YMDD基本原理：确定探针特
9、定的TM值来区 分是否突变。常用方法：覆盖突变位点荧光双探针杂交的方 法检测YMDD。TM值：在核酸加热变性过程中，当双链DNA 解链到一 半时所对应的温度就是该核 酸的TM值，也叫核酸的熔点。每种不 同的核酸有不同的TM值(特征常数特征常数)。影响TM值的主要因素1.碱基中GC含量，含量越高，TM越大。2.核酸的长度，核酸越长，TM越大。3.完全配对比不完全配对时TM值要大。溶解曲线分析溶解曲线分析（TmTm）YIDDYIDDYIDDYIDDYMDDYMDDYMDDYMDDYVDDYVDDYVDDYVDDYMDD+YIDDYMDD+YIDD加热核酸时荧光强度变化曲线，当荧光陡变为0时所对应的
10、温度就是TM值。同样的核酸序列不同浓度TM值相同不同核酸TM值不同4040404070707070YVDDYMDDYIDDYMDD突变的熔解曲线检测原理YMDD：TM值显示54.64CYIDD：TM值显示46.91CYVDD：TM值显示50.74C46.91C 54.64C 50.74CYIDD YMDD YVDD临床资料临床资料标标本本2005年年9月月-2006年年12月月来来省省立立医医院院感感染染科科就就诊诊的的慢慢性性乙乙肝肝患患者者187例例，接接受受拉拉米米夫夫定定用用药药20天天-36个个月月，年年龄龄12-66岁岁，男男性性110人人，女女性性77人人。其其中中HBV-DNA
11、 103C0PIES/ML157例例，HBV-DNA含含量量为为2.0103-8.0108C0PIES/ML，HBV-DNA 103C0PIES/ML30例。例。试试剂剂乙乙肝肝病病毒毒核核酸酸荧荧光光PCR检检测测试试剂剂购购置置中中山山大大学学达达安安基基因因股股份份有有限限公公司司，荧荧光光PCR检检测测通通用用试试剂剂和和HBV-DNA提提取取试试剂剂由由上上海海复复星星医医学学科科技技发发展展有有限限公公司司提提供供，引引物物及及探探针针由由上上海海百曼生物技术有限公司合成。百曼生物技术有限公司合成。突变类型突变类型相相 符符 例例数数不不相相符符例例数数突突 变变 的的 含含量（量
12、（%）HBV-DVA含含量量（Copies/ml）YMDD23108.0103-6.0108YIDD21010.9-1009.0103-5.0108YVDD17011.42-1008.0104-7.5108YIDD/YVDD7011.18-1002.0105-6.1108合计合计681项目开展情况项目开展情况ATG:rtM204（正常）（正常）GTG:rtM204（V变异）变异）ATT:rtM204（I变异）变异）ATT/GTG:rtM204(I/V双杂合子峰双杂合子峰) 我我们们用用实实时时荧荧光光定定量量PCR方方法法检检测测187例例临临床床乙乙肝肝患患者者血血清清标标本本，观观察察HBV的的YMDD变变异异情情况况，同同时时用用测测序序法法作为金标准比对验证。作为金标准比对验证。 结结果果表表明明，此此方方法法在在临临床床YMDD变变异异诊断中具有快速、灵敏和特异的特点。诊断中具有快速、灵敏和特异的特点。结结 论论
