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1、第三章第三章 细胞生物学的研究方法细胞生物学的研究方法细胞生物学研究的方法细胞生物学研究的方法细胞的显微结构细胞的显微结构细胞的亚显微结构细胞的亚显微结构分子生物学上观察结构与功能的统一分子生物学上观察结构与功能的统一结构与功能结构与功能细胞的生命活动与现象（本质是不同基因在不同时细胞的生命活动与现象（本质是不同基因在不同时间与空间的表达与动态变化）间与空间的表达与动态变化）观察细胞的手段与方法观察细胞的手段与方法细胞组分分离的方法细胞组分分离的方法蛋白质分离纯化与鉴定的方法蛋白质分离纯化与鉴定的方法(柱层析，电泳，等）（属于生物化学）柱层析，电泳，等）（属于生物化学）分子生物学的方法分子生物
2、学的方法DNA 操作（操作（PCR， Southern blot，in situ hybridization)RNA 应用应用(RT-PCR, Northern blot, siRNA)Protein over-expression in a cell细胞培养及细胞分离细胞培养及细胞分离transformationTransfections(3种）infection要求了解的技术与方法要求了解的技术与方法Protein down-expression in a cell (siRNA)蛋白质相互作用的研究技术蛋白质相互作用的研究技术Co-IPYeast two-hybridization其它其
3、它生物芯片技术生物芯片技术-cDNA microarray蛋白质组学蛋白质组学-Mass spectrometry 细胞内分子定位：细胞内分子定位：酶细胞化学技术酶细胞化学技术免疫化学技术免疫化学技术放射自显影放射自显影细胞内分子示踪细胞内分子示踪离子探针离子探针GFPFRETDNA 文库，文库，cDNA文库文库第一节第一节 显微镜技术显微镜技术一一.光学显微镜技术光学显微镜技术（一）普通光学显微镜的分辨率极限是（一）普通光学显微镜的分辨率极限是0.2mR=0.61/n*sin（二）（二） 相差显微镜通常用于观察活细胞相差显微镜通常用于观察活细胞（三）暗视野显微镜通过散射光成像（三）暗视野显微
4、镜通过散射光成像（四）荧光显微镜可用于特异分子的细胞定位（四）荧光显微镜可用于特异分子的细胞定位抗体可用于检测特异的分子抗体可用于检测特异的分子Primary antibody: rabbit antibodySecondary antibody: goat anti-rabbit IgG免疫绵羊免疫绵羊得到抗体得到抗体纯化后标记纯化后标记吖啶橙荧光染色（血涂片）吖啶橙荧光染色（血涂片） 吖啶橙吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色溴化乙锭双荧光染色 acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) （五）共聚焦显微镜可通过虑出不聚集的光从而提供清晰图像（五）共聚焦显微镜可
5、通过虑出不聚集的光从而提供清晰图像（六）显微电影摄影技术能记录细胞或细胞器的运动过程（六）显微电影摄影技术能记录细胞或细胞器的运动过程二二. 电子显微镜技术电子显微镜技术光学显微镜的分辨率较低光学显微镜的分辨率较低电子显微镜的最高分辨率是电子显微镜的最高分辨率是0.002nm(理论，实际上不超过理论，实际上不超过0.1nm)生物学标本：生物学标本：2nm（一）投射电子显微镜用于观察细胞的超微结构（一）投射电子显微镜用于观察细胞的超微结构Specific Macromolecules can be localized by immunogold electron micriscopyMetal
6、shadowing allows surface features to be examined at high resolution by Transmission electron microscopy投射电镜所用的一些方法投射电镜所用的一些方法金属投影法（金属投影法（metal shadowing)冰冻断裂法（冰冻断裂法（freeze-fracture)冰冻蚀刻冰冻蚀刻(freeze-etching)（二）扫描电子显微镜常用于观察生物样品表明的立体结构（二）扫描电子显微镜常用于观察生物样品表明的立体结构Different views of a single object can be c
7、ombined to give a three-dimensional reconstruction CT (computed tomography)Electron-microscopy (EM) tomography（EMT)第二节第二节 细胞的分离和培养细胞的分离和培养一一. 不同类型细胞的分离不同类型细胞的分离怎样分离细胞？怎样分离细胞？ 怎样纯化细胞？怎样纯化细胞？分离细胞分离细胞：用胰蛋白酶，用胰蛋白酶，EDTA去处理小组织块去处理小组织块（从组织水平到细胞水平）（从组织水平到细胞水平）关于纯化细胞：关于纯化细胞：（一）差速离心或密度梯度离心（一）差速离心或密度梯度离心（粗分离粗分
8、离）（二）流式细胞技术（二）流式细胞技术（三）根据细胞表面抗原的情况进行细胞纯化（三）根据细胞表面抗原的情况进行细胞纯化（四）激光捕获显微切割技术（四）激光捕获显微切割技术二二.细胞培养细胞培养（一）细胞培养的全过程必须在无菌的环境下进行（一）细胞培养的全过程必须在无菌的环境下进行（二）（二） 细胞培养的方式是原代与传代培养细胞培养的方式是原代与传代培养（三）来源于体内的细胞可在体外建系（三）来源于体内的细胞可在体外建系细胞系细胞系(cell line)细胞株细胞株(cell strain)（四）细胞融合可以产生杂交细胞（四）细胞融合可以产生杂交细胞（五）胚胎干细胞可促进医学的革命（五）胚胎干
9、细胞可促进医学的革命胚胎干细胞的概念胚胎干细胞的概念 Embryonic stem cell, ESC 构建基因敲除动物（构建基因敲除动物（knockout animal）扩大培养用作基因敲除动物扩大培养用作基因敲除动物Positive and negative selectionNeoTKXXXneoTK(thymidine kinase)ganciclovir derivativeKill the cell+-iPS,Induced Pluripotent Stem Cells Yamanaka at Kyoto University Oct3/4, Sox2, c-Myc, and Kl
10、f4 Junying Yu, James Thomson at University of WisconsinMadison Oct4, Sox2, Nanog and Lin28 第三节第三节 细胞组分的分离和纯化技术细胞组分的分离和纯化技术（一）差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒（一）差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒一一. 细胞组分的分级离心细胞组分的分级离心（从细胞器水平到分子水平）（从细胞器水平到分子水平）（二）速度沉降分离沉降系数不同的颗粒（二）速度沉降分离沉降系数不同的颗粒（三）（三） 平衡沉降分离密度不同平衡沉降分离密度不同 的颗粒的颗粒Velocity sedimenta
11、tionEquilibrium sedimentation 二、层析法分离蛋白质二、层析法分离蛋白质三、蛋白电泳三、蛋白电泳（一）（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳依据分子量的不同分离蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳依据分子量的不同分离蛋白质（二）等点聚集电泳依据等电点不同分离蛋白质（二）等点聚集电泳依据等电点不同分离蛋白质（三）（三） 双向电泳可一次分离数千种蛋白双向电泳可一次分离数千种蛋白第四节第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术细胞化学和细胞内分子示踪技术一一. 酶细胞化学技术酶细胞化学技术二二.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术二二.免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术一抗一抗：rb, mouse二抗：
12、羊抗兔，羊抗鼠二抗：羊抗兔，羊抗鼠用兔子用兔子IgG去免疫绵羊去免疫绵羊标记荧光素标记荧光素How can we detect that a protein was made in cells or bacteria ?Western blotProbe（Antibodies specific for some specific proteins ）Steps for Western blot1. Prepare samples, extract protein solution form tissue or culture cells2. Resolve the proteins by SD
13、S-PAGE (SDS- polyacrylamide gel electrophoresis) 3.Transfer the resolved protein into a membrane (PDVF, Nitrocellulose) 4. Blocking 2% BSA (Bovine serum albumin ) or no fat milkTo block the unbinding site of the protein . To eliminate the non specific Binding .5. Detection 1)Primary antibody to reco
14、gnize the specific protein 2)Secondary antibody labeled with Enzymes, isotope, Fluorescent Most popular used method is Enzyme labeling Alkaline phosphatase and horseradish peroxidase Chemiluminescence Substrate Light expose to a photograph filmDevelop into a bandAvian Leukosis Virus 三三. 放射自显影放射自显影放射
15、自显影技术（放射自显影技术（autoradiography)3H-亮氨酸，亮氨酸，32S-蛋氨酸标记蛋白蛋氨酸标记蛋白3H-胸腺嘧啶脱氧核苷、胸腺嘧啶脱氧核苷、 3H-胸腺、胸腺、 3H-尿苷标记核酸尿苷标记核酸放射性标记的有丝分裂标记法放射性标记的有丝分裂标记法放射性标记的有丝分裂标记法放射性标记的有丝分裂标记法（percentage labeled mitosespercentage labeled mitoses，PLMPLM）：原理是对测定细胞进：原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记
16、有丝分裂细胞百分数过统计标记有丝分裂细胞百分数(PLM)的办法来测定细胞周期的办法来测定细胞周期.四四. 活细胞内分子示踪活细胞内分子示踪（一）离子探针进行细胞内离子的实时检测（一）离子探针进行细胞内离子的实时检测用钙离子探针观察细胞内钙离子的动态变化用钙离子探针观察细胞内钙离子的动态变化（二）绿色荧光蛋白用于显示特定蛋白在细胞内的定位（二）绿色荧光蛋白用于显示特定蛋白在细胞内的定位绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP)238 AA450-490nm520nmAdv Rem was used to infect Hep G2 cells He
17、p G2controlHep G2Infection Adv RemGFP， a report gene1.Monitor plamid existence, therefore, monitor the transfection rate. 2.Monitor gene expression3.Detecting the location of a protein by making GFP fusion proteinGFP fusion proteinExpression of H2B-GFP before and after UV-B-induced apoptosis. A431 c
18、ells were stably transfected with H2B-GFP fusion protein (K/H2B-GFP). H2B-GFP is expressed only within the nuclei. In the right panel an apoptotic K/H2B-GFP cell is shown after UV-B irradiation. The “Blebs and bodies forming” phase is shown. Noticeably, redistribution of SLE self antigens are among
19、the remarkable changes that occur during apoptosis. Images were collected in real time by laser confocal microscopy.GFP expression in haematopoietic colonies from transgenic mice carrying the green fluorescent protein (GFP)-reporter gene under the control of Kit (stem cell factor receptor) regulator
20、y elements. These mouse lines provide useful means to mark rare adult multipotential cells which, upon transplantation, can be monitored for their ability to engraft, differentiate and regenerate different tissues. （三）荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白与蛋白的相互作用（三）荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白与蛋白的相互作用荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（fluoresce
21、nce resonance energy transfer, FRET)Cy3-cy5, Alexa546-Alexa647; CFP-YEP, BFP-EGFPB.荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白与蛋白的相互作用荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白与蛋白的相互作用荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（florescence resonance energy transfer, FRET)Cy3-cy5, Alexa546-Alexa647; CFP-YEP, BFP-EGFPExcitation:402nmemission 475nmExcitation: max395nm和min470n
22、m Emission:509nm B.荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白与蛋白的相互作用荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白与蛋白的相互作用荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（florescence resonance energy transfer, FRET)Cy3-cy5, Alexa546-Alexa647; CFP-YEP, BFP-EGFPExcitation:402nmemission 475nmExcitation: max395nm和min470nm Emission:509nm 第五节第五节 细胞功能基因组学研究技术细胞功能基因组学研究技术一一. DNA基本研究技术基本研
23、究技术（一）限制性核酸内切酶可特定位点切断（一）限制性核酸内切酶可特定位点切断DNA分子分子（常规的分子生物学技术之一）（常规的分子生物学技术之一）（二）不同支持物的电泳分离不同（二）不同支持物的电泳分离不同 大小的大小的DNA分子分子（常规的分子生物学技术之二）（常规的分子生物学技术之二）（三）聚合酶链式反应对特定的（三）聚合酶链式反应对特定的DNA序列进行复制序列进行复制聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR)DNARNAmRNA tRNA rRNAProteinReplication Transcription Translation
24、 Reversed transcription DNA in vitro amplification (PCR) The discovery of Taq enzyme. Taq DNA polymerase is a thermostable DNA polymerase that prossesses a 5- 3polymerase activity and aDouble strand specific 5-3 exonuclease activity.94C 1-94C 30-55C 1-72C X mins-72C 10min30 cycles（常规的分子生物学技术之三）（常规的分
25、子生物学技术之三）（四）（四）DNA文库和基因克隆是实验室常用的工具与方法文库和基因克隆是实验室常用的工具与方法Genomic DNA libraryPlasmid, cosmid cDNA library（五）测定（五）测定DNA序列的基本方法是双脱氧链末端合成终止法序列的基本方法是双脱氧链末端合成终止法DNA序列测定的条件序列测定的条件：1. 能分辨一个碱基差别的单链能分辨一个碱基差别的单链DNA2. 形成一系列的单链形成一系列的单链DNA(DNA polymerase)英国人 SangerATCGGGCCAATTCCTAATCGGGCCAATTCCTATCGGGCCAATTCCATCGG
26、GCCAATTC ATCGGGCCAATTATCGGGCCAATATCGGGCCAAATCGGGCCAATTCCTAATCGGGCCA引物引物模板模板AGCP-o-P-Deoxyguanine5-triphosphate(dGTP)(A uncleotide)DNA polymerase2. DNA sequencingHDideoxyguanine 5-triphosphate(ddGTP)CGTA反应体系中的底物多为反应体系中的底物多为dNTP,少量少量ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP二二. 基因表达的定量分析基因表达的定量分析核酸分子杂交用于检测组核酸分子杂交用于检测组织或
27、细胞中的互补序列织或细胞中的互补序列1. 原位杂交（原位杂交（in situ hybridization, ISH)核酸杂交的概念核酸杂交的概念用于杂交的探针是体外用于杂交的探针是体外合成的带有标记的合成的带有标记的DNA片段片段2. Southern blot：用于检测：用于检测DNA的方法的方法 (现在多被现在多被PCR取代）取代）3. Northern blot ：用于检测：用于检测mRNA水平的方法水平的方法(现在多被现在多被RT-PCR取代）取代）可以用可以用PCR技术结合技术结合DNA序列分析来确定基因的存在甚至拷贝数的多少。序列分析来确定基因的存在甚至拷贝数的多少。荧光实时荧光实
28、时PCR技术室检测基因表达变化的常规技术技术室检测基因表达变化的常规技术mRNAcDNARTPCR荧光实时荧光实时PCR技术室检测基因表达变化的常规技术技术室检测基因表达变化的常规技术mRNAcDNARTPCR模板模板三三. 基因表达的上调与下调技术基因表达的上调与下调技术用转基因技术让细胞某基因表达升高用转基因技术让细胞某基因表达升高用转基因技术让细胞内某基因表达降低用转基因技术让细胞内某基因表达降低Knock outKnock down基因敲除敲出向细胞内导入分子的方法向细胞内导入分子的方法1.脂质体法（脂质体法（转染转染）2.电转移法电转移法 （转染转染）3. 显微注射（转染）显微注射（
29、转染）4.病毒病毒感染感染法法向细胞内导入分子的方法向细胞内导入分子的方法1.脂质体法（脂质体法（转染转染）2.电转移法电转移法 （转染转染）3. 显微注射显微注射（转染）（转染）4.病毒病毒感染感染法法实验室用的病毒是病毒复制缺陷型的。实验室用的病毒是病毒复制缺陷型的。包装出来的病毒缺少一些包装蛋白，因而不能包装出来的病毒缺少一些包装蛋白，因而不能包装出新病毒，制备病毒需要借助于特殊的包装细胞包装出新病毒，制备病毒需要借助于特殊的包装细胞但病毒的其它特性仍然保留但病毒的其它特性仍然保留感染细胞的生物特性感染细胞的生物特性遗传物质复制的特性遗传物质复制的特性利用宿主细胞表达蛋白的体系表达自己蛋
30、白的特性利用宿主细胞表达蛋白的体系表达自己蛋白的特性外源基因可以在原核及真核细胞中表达外源基因可以在原核及真核细胞中表达外源基因在细胞内的表达靠质粒载体及病毒载体外源基因在细胞内的表达靠质粒载体及病毒载体PCMVMCSpolyASV40HygromycinSV40 pAAmpicillin Bacteria Selecting GeneAmpKanpromoterSV40 or PCMVFor Mam f1 oriSelection markerHyg, neo, ZeoPlasmid replication starting sequence“奢侈基因奢侈基因”RNA 干扰技术干扰技术Sma
31、ll interfering RNAsiRNA: small interfering RNAshRNA : small hairpin RNARNAi: RNA interferenceSmall interfering RNA Small interfering RNA (siRNA), sometimes known as short interfering RNA or silencing RNA, are a class of 20-25 nucleotide-long double-stranded RNA molecules that play a variety of roles
32、 in biology .Most notably, it is involved in the RNA interference(RNAi) pathway where the siRNA interferes with the expression of a specific gene. StructureDiscoveryDiscoveryDavid Baulcombes group in Norwich, England, as part of post-transcriptional gene silencing (PTGS) in plants, and published the
33、ir findings in Science in a paper titled A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants Thomas Tuschl and colleagues , synthetic siRNAs were shown to be able to induce RNAi in mammalian cells, published in Nature How to design a siRNAAnnealing 四四. 蛋白质相互作用的研究技术蛋白质相互作
34、用的研究技术（一）免疫共沉淀可验证蛋白（一）免疫共沉淀可验证蛋白-蛋白间的相互作用蛋白间的相互作用Immunoprecipitation (IP)RegularWestern blotCo-immunoprecipitation (co-IP)（二）酵母双杂交用于筛选相互作用的蛋白质（二）酵母双杂交用于筛选相互作用的蛋白质Yeast Two-Hybrid Protein B and Protein P interactionProtein B Protein P （三）（三）FRET法检测两个分子间的相互作用法检测两个分子间的相互作用五五. 蛋白质与核酸相互作用的研究技术蛋白质与核酸相互作用的
35、研究技术（一）染色质免疫沉淀技术研究（一）染色质免疫沉淀技术研究DNA与蛋白质的与蛋白质的 相互作用相互作用ChIP: chromatin immunoprecipitation （二）紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合 蛋白相互作用六六 . 生物芯片技术生物芯片技术生物芯片（生物芯片（biochip)DNA microarraycDNA microarrayProtein ChIPExample of an approximately 40,000 probe spotted oligo microarray with enlarged inset to show detail. 七七.
36、 蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术Mass spectrometry（质谱（质谱） 八. 高通量测序技术九. 模式动物个体水平的基因操作技术（转基因动物的产生于应用）一般的转基因动物一般的转基因动物，微注射目的微注射目的cDNA plamid 于胚泡，于胚泡，然后移入假孕鼠子宫，发育。然后移入假孕鼠子宫，发育。基因敲除小鼠基因敲除小鼠：把细胞培养中获得的：把细胞培养中获得的gene knock-out ES cell注射到胚泡中，移入假孕鼠子宫，发育形成嵌合体。注射到胚泡中，移入假孕鼠子宫，发育形成嵌合体。Positive and negative selectionNeoTKXXXneo
37、TK(thymidine kinase)ganciclovir derivativeKill the cell+-转基因动物与基因敲出动物都要经过转基因动物与基因敲出动物都要经过PCR技术进行鉴定技术进行鉴定第六节第六节 生物大分子的结构测定生物大分子的结构测定一一. 核磁共振技术核磁共振技术核磁共振光谱仪（核磁共振光谱仪（nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)二二. X-射线衍射技术射线衍射技术小结：小结：观察细胞的手段与方法观察细胞的手段与方法细胞组分分离的方法细胞组分分离的方法蛋白质分离纯化与鉴定的方法蛋白质分离纯化与鉴定的方法(柱层析
38、，电泳，等）柱层析，电泳，等）分子生物学的方法分子生物学的方法DNA 操作（操作（PCR， Southern blot，in situ hybridization)RNA 应用应用(RT-PCR, Northern blot, siRNA)Protein over-expression in a cell细胞培养及细胞分离细胞培养及细胞分离细胞内分子定位：细胞内分子定位：酶细胞化学技术酶细胞化学技术免疫化学技术免疫化学技术放射自显影放射自显影细胞内分子示踪细胞内分子示踪离子探针离子探针GFPFRETtransformationTransfections(3种）infection蛋白质相互作用的
39、研究技术蛋白质相互作用的研究技术Co-IPYeast two-hybridization其它其它（FRET）生物芯片技术生物芯片技术-cDNA microarray蛋白质组学蛋白质组学-Mass spectrometry 生物大分子的结构测定生物大分子的结构测定Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMRX-ray diffractionTerms : FRET(fluorescence resonance energy transfer), ChIP(chromatin immunoprecipitation) , Co-IP(Co-immunoprecipitation),ISH (in situ hybridization)iPS (Induced Pluripotent Stem Cells)
