《学时试验十二肝脏谷丙转氨酶活力测定综合性》由会员分享，可在线阅读，更多相关《学时试验十二肝脏谷丙转氨酶活力测定综合性（83页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物化学实验生物化学实验 课程简介生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课，生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课，本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技术及典型仪器设备。
2、通过实验有助于学生加深对生物化学的基本术及典型仪器设备。通过实验有助于学生加深对生物化学的基本知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术。经典的、常规的、以及现代的方法与技术。目 录l实验一实验一 氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定纸层析法纸层析法 ( (操作性操作性) 4) 4学时学时l实验二实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 ( (操作性操作性) 3) 3学时学时l实验三实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 ( (验证性验证性)
3、5) 5学时学时l实验四实验四 动物肝肝脏动物肝肝脏DNA的分离与鉴定的分离与鉴定 ( (操作性操作性) 3) 3学时学时l实验五实验五 血液中葡萄糖的测定血液中葡萄糖的测定 ( (操作性操作性) 3) 3学时学时l实验六实验六 血清中总胆固醇的测定血清中总胆固醇的测定 ( (操作性操作性) 4) 4学时学时l实验七实验七 唾液淀粉酶活性的观察唾液淀粉酶活性的观察 ( (综合性综合性) 4) 4学时学时l实验八实验八 维生素维生素C的定量测定的定量测定 ( (操作性操作性) 4) 4学时学时l实验九实验九脂肪酸的脂肪酸的-氧化氧化(操作性操作性) 4 4学时学时l实验十实验十琼脂糖胶电泳法分离
4、乳酸脱氢同工酶琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶(操作性操作性) 4 4学时学时l实验十一实验十一酪蛋白的制备酪蛋白的制备(操作性操作性) 4 4学时学时l实验十二实验十二肝脏谷丙转氨酶活力测定肝脏谷丙转氨酶活力测定(综合性综合性) 3 3学时学时实验一实验一 氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定纸层析法纸层析法 【实验目的实验目的】1. 1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。掌握纸上层析的一般原理和操作方法。掌握纸上层析的一般原理和操作方法。掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2. 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。了解氨基酸的特征性颜色反应。了解氨基酸的特征性颜色反应。了解氨基酸的特征性颜色反应。
5、 3. 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。学会分析未知样品的氨基酸成分。学会分析未知样品的氨基酸成分。学会分析未知样品的氨基酸成分。【实验原理实验原理】纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所类、抗生素等有
6、机物质的一项重要而简便的分析方法。所类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。研和生产分析工作中。研和生产分析工作中。研和生产分析
7、工作中。纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的
8、亲和力，而与有机纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配相中分配
9、比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的一般来说，在相同的条件下，每种物质
10、都有其固定的一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的RfRf值。值。值。值。RfRf值的定义为：值的定义为：值的定义为：值的定义为：RfRf=(=(原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离)/ )/（原点到溶剂前沿的（原点到溶剂前沿的（原点到溶剂前沿的（原点到溶剂前沿的距离）距离）距离）距离）用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献
11、记载的该物质层析条件，根据没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献文献文献文献RfRf值进行鉴定值进行鉴定值进行鉴定值进行鉴定。【实验试剂与器材实验试剂与器材】1、溶剂系统、溶剂系统（1）碱相溶剂：）碱相溶剂：正丁醇正丁醇正丁醇正丁醇:12%:12%氨水氨水氨水氨水:95%:95%乙醇乙醇乙醇乙醇13:3:313:3:3（体积比）（体积比）（体积比）（体积比）（2）酸相溶剂：）酸相溶剂：正丁醇正丁醇正丁醇正丁醇:80%:80%甲酸甲酸甲酸甲酸: :水水水水15:3:215:3:2（体积比
12、）（体积比）（体积比）（体积比）2、显色贮备液：、显色贮备液：0.1%0.1%水合茚三酮丙酮溶液水合茚三酮丙酮溶液水合茚三酮丙酮溶液水合茚三酮丙酮溶液3、V（0.1%硫酸铜）硫酸铜）:V（75%乙醇）乙醇）=2:38溶液。溶液。4、混合氨基酸溶液、混合氨基酸溶液6mg/ml。5、滤纸。、滤纸。6、烧杯、烧杯10ml（1）。）。7、剪刀。、剪刀。8、层析缸（、层析缸（2）。）。9、微量注射器、微量注射器10l（1）或毛细管。）或毛细管。10、电吹风（、电吹风（1）。）。11、722型（或型（或7220型）分光光度计。型）分光光度计。【实验步骤实验步骤】1 1纸的处理纸的处理纸的处理纸的处理取取取
13、取18cm18cm长、长、长、长、18cm18cm宽的滤纸一张，离底边宽的滤纸一张，离底边宽的滤纸一张，离底边宽的滤纸一张，离底边2cm2cm处用处用处用处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点点样点点样点点样点( (原点原点原点原点) )划圈，使圈的直径小于划圈，使圈的直径小于划圈，使圈的直径小于划圈，使圈的直径小于0.5cm0.5cm。2 2点样点样点样点样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸
14、的代号（混合样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写可写可写可写MM），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点1 1次。每个样品次。每个样品次。每个样品次。每个样品共点共点共点共点2 2次。次。次。次。 3 3层析层析层析层析将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点将点好
15、样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触( (见图见图见图见图1)1)。将培养皿中放入将培养皿中放入将培养皿中放入将培养皿中放入2 23 3量的展层剂，放入层析缸中，量的展层剂，放入层析缸中，量的展层剂，放入层析缸中，量的展层剂，放入层析缸中，然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下
16、垂直放然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。当溶剂前沿到达离上端当溶剂前沿到达离上端当溶剂前沿到达离上端当溶剂前沿到达离上端2cm2cm处，取出滤纸，用铅笔处，取出滤纸，用铅笔处，取出滤纸，用铅笔处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿，晾干。描出溶剂前沿，晾干。描出溶剂前沿，晾干。描出溶剂前沿，晾干。图图1滤纸的缝合滤纸的缝合4 4显色显色显色显色用喷雾器向滤纸上均匀喷洒用喷雾器向滤纸上均
17、匀喷洒用喷雾器向滤纸上均匀喷洒用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%0.1%茚三酮，晾干后，茚三酮，晾干后，茚三酮，晾干后，茚三酮，晾干后，将滤纸放入烘箱中将滤纸放入烘箱中将滤纸放入烘箱中将滤纸放入烘箱中(80-100)(80-100)，烘烤，烘烤，烘烤，烘烤5 5分钟后，滤纸上即分钟后，滤纸上即分钟后，滤纸上即分钟后，滤纸上即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓( (见图见图见图见图2)2)。图图图图2. 2.层析谱层析谱层析谱层析谱1 1原点；原点；原点；原点；2
18、2层析点；层析点；层析点；层析点；3 3溶剂前沿溶剂前沿溶剂前沿溶剂前沿5 5计算计算计算计算用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的RfRf值。值。值。值。【注意事项注意事项】(1)(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸在整个操作过程中，手只能接触滤纸在整个操作过程中，手只能接触滤纸在整个操作过程中，手只能接触滤纸边
19、缘边缘边缘边缘，否则手指，否则手指，否则手指，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。 (2)(2)在在在在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 (3)(3)展层结束后，切展层结束后，切展层结束后，切展层结束后，切勿忘记勿忘记勿忘记勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。用铅笔描出溶剂前沿。用铅笔描出溶剂前沿。用铅笔描出溶剂前沿。 (4)(4)点样斑点不能太大（其直径应小于点样斑点不能太大（其直径应小于点样斑点不能太大（
20、其直径应小于点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm0.5cm），防止），防止），防止），防止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 (5)(5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。根据目的、要求，选择合适溶剂系统。根据目的、要求，选择合适溶剂系统。根据目的、要求，选择合适溶剂系统。实验二实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 【实验目的实验目的】学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。学习考马斯亮蓝法测定蛋白
21、质浓度的原理和方法。【实验原理实验原理】考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质-染料结合染料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色形式，红色存在着两种不同样色形式，红色-棕棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色棕黑色和蓝色形式，最大光吸收由形式，最大光吸收由465nm变成变成595nm，测定，测定595nm吸光吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。蛋白质
22、与染料结合速度很快，蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全，就可以反应完全，并可以稳定并可以稳定1h，蛋白质，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数，染料复合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100g蛋白质，微量测定时达到蛋白质，微量测定时达到1-10g蛋白质。此反应反复性好蛋白质。此反应反复性好精度高，线性关系好。精度高，线性关系好。【实验试剂与器材实验试剂与器材】1、标准蛋白液（、标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛血清白蛋白用结晶牛血清白蛋白用0.9%NaCl稀释到稀释到2000ml。2、0.9%N
23、aCl3、考马斯亮蓝试剂：、考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250溶于溶于50ml5%乙醇中，加乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸馏水稀释磷酸，蒸馏水稀释1000ml，滤纸过滤。，滤纸过滤。4、待测蛋白：人血清，用前用、待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl稀释稀释200倍。倍。5、漩涡混合器、漩涡混合器6、移液管、移液管0.5ml（2），），1.0ml（2），），5ml（1）7、分光光度计、分光光度计8、试管、试管1.5cm15cm(8)9、量筒、量筒100ml(1)10、电子分析天平、电子分析天平11、试管架、试管架(1)【实验步骤实验步骤】一、标准曲线线的绘制一、标准曲
24、线线的绘制取取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准曲线。曲线。试管号试管号试剂试剂1234561mg/ml标准标准蛋白液蛋白液/ml0.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl/ml10.90.80.70.60.4考马斯亮蓝考马斯亮蓝染液染液/ml4.04.04.04.04.04.0摇匀，摇匀，1小时内以小时内以1号管为空白对照，在号管为空白对照，在595nm处比色处比色A595nm二、未知样液的测定二、未知样液的测定另取一干净试管，加
25、入样品另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置，混匀，室温静置3min，于波长，于波长595nm处比色，读处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项注意事项】1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。定吸光度，在这段时间内样色很稳定。2、测定中，蛋白质、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验染料复合物会吸附在比色皿上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。证明可以忽视。测定完后可以用
26、乙醇洗干净。【思考题思考题】1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白质浓度。质浓度。（1）样品不容易溶解，但要求结果很准确。）样品不容易溶解，但要求结果很准确。（2）要求在半天内测定）要求在半天内测定60个样品。个样品。（3）要求很迅速的测定一系列试管（）要求很迅速的测定一系列试管（30只）中溶液的蛋只）中溶液的蛋白质浓度白质浓度2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。实验三实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 【实验目的实验目的】掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。掌握
27、醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。【实验原理实验原理】血清中各种蛋白质的等电点不同，在血清中各种蛋白质的等电点不同，在pH8.6的巴比的巴比妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等，蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等，例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在pH8.6时带的负时带的负电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此在电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此在电场中比其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在电场中比其他蛋白质移动速
28、度快。这样，血清蛋白质在醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分离和分析蛋醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分离和分析蛋白质。白质。【实验试剂与器材实验试剂与器材】（一）仪器（一）仪器1、电泳仪；、电泳仪；2、电泳槽；、电泳槽；3、恒温水浴箱；、恒温水浴箱；4、721型分光光度计型分光光度计（二）材料（二）材料1、人血清或鸡血清、人血清或鸡血清2、醋酸纤维素薄膜、醋酸纤维素薄膜（三）试剂（三）试剂1、0.05mol/L巴比妥钠巴比妥钠-HCL缓冲液（缓冲液（pH8.6）：取巴）：取巴比妥钠比妥钠10.3g，加蒸馏水约，加蒸馏水约800ml溶解后，加入溶解后，加入lmol/LHCL9.55ml，
29、补加蒸馏水至，补加蒸馏水至1000ml，测试其，测试其pH应应为为8.6。2、染色液：取氨基黑、染色液：取氨基黑10B1.0g，磺基水杨酸，磺基水杨酸10g，加冰，加冰醋酸醋酸20ml，蒸馏水，蒸馏水400ml，摇匀溶解。，摇匀溶解。3、漂洗液：、漂洗液：2.5醋酸醋酸4、洗脱液：、洗脱液：0.02mol/LNaOH溶液溶液5、透明液：无水乙醇、透明液：无水乙醇7份，冰醋酸份，冰醋酸3份混合即成。份混合即成。【实验步骤实验步骤】1薄膜准备薄膜准备2点样点样3电泳电泳4染色和漂洗染色和漂洗5薄膜和透明薄膜和透明6定量定量（1）洗脱法）洗脱法注意！白蛋白因加入注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管
30、多，其光密度值的量比其他管多，其光密度值应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。+白蛋白白蛋白(A)21（2）光密度计法）光密度计法（3）用本法定量，正常人数值为：）用本法定量，正常人数值为：白蛋白白蛋白54.0%73.0%540730g/L1球蛋白球蛋白2.8%5.1%2851g/L2球蛋白球蛋白6.3%10.6%63106g/L球蛋白球蛋白5.2%11.0%52110g/L球蛋白球蛋白12.5%20.0%125200g/L【注意事项注意事项】1醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用同一批号、薄膜厚
31、度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。2血清或其他电泳样品应新鲜。血清或其他电泳样品应新鲜。3点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样位置要合适。位置要合适。4盐桥要放置平整，保证电场均匀。盐桥要放置平整，保证电场均匀。5电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。6较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不宜过高。宜过高。7选择合适的缓冲液离子强度。选择合适的缓冲液离子强度。8两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。两电泳槽内缓冲液面应在
32、同一水平。9要控制好电流，电压和电泳时间。要控制好电流，电压和电泳时间。10电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减少缓冲液的污染、水分蒸发、少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变，及离子强度的改变，并应防止霉菌的滋长。并应防止霉菌的滋长。11染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性良好的定量结果。良好的定量结果。【思考题思考题】1.电泳后，泳动在最前面的为何种蛋白质？分析原因。电泳后，泳动在最前面的为何种蛋白质？分析原因。2.点样时，置于电场的正极还是负极，为什么？点样时，置于电场的正极还
33、是负极，为什么？实验四实验四 动物肝肝脏动物肝肝脏DNADNA的分离与鉴定的分离与鉴定【实验目的实验目的】学习常用的学习常用的DNA分离方法分离方法。【实验原理实验原理】在浓氯化钠在浓氯化钠(1-2mol/L)溶液中，脱氧核糖蛋白的溶溶液中，脱氧核糖蛋白的溶解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠(0.14mol/L)溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核
34、蛋白从样品中分别从样品中分别抽提出来。抽提出来。将抽提的核蛋白用将抽提的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)处理，处理，DNA(或或RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白异戊醇将蛋白质沉淀除去，而质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液则溶解于溶液中。向溶液中加入适中加入适量乙醇，量乙醇，DNA即析出。即析出。为了防止为了防止DNA(或或RNA)酶解，提取时加入酶解，提取时加入EDTA(乙二乙二胺四乙酸）。胺四乙酸）。【实验试剂与器材实验试剂与器材】15mol/LNaCl溶液：将溶液：将292.3gNaCl溶于水，稀释至溶于水，稀释至1000ml。2
35、0.14molNaCl-0.15molEDTA-Na溶液：溶液：溶溶8.18gNaCl及及37.2gEDTANa于蒸馏水，稀释至于蒸馏水，稀释至1000ml。325SDS溶液：溶溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于十二烷基硫酸钠于100ml45乙醇。乙醇。0.015mol/LNaCl-0.0015mol柠檬酸三钠溶液柠檬酸三钠溶液,氯氯化化钠钠0.828g及柠檬酸三钠及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水溶于蒸馏水,稀释至稀释至1,000ml。5氯仿氯仿-异戊醇混合液异戊醇混合液:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇=24:1(V/V)。61.5mol/LNaCl-015mol柠檬酸三钠溶液柠檬酸三钠溶液:氯化氯化钠
36、钠82.8g及柠檬酸三钠及柠檬酸三钠34.1g溶于蒸馏水溶于蒸馏水,稀释至稀释至1,000ml。73mol/L乙酸钠乙酸钠-0.001molEDTA-Na溶液：称取溶液：称取乙乙酸钠酸钠408g、EDTA-Na0.372g溶于蒸馏水溶于蒸馏水,稀释至稀释至1,000ml。870%乙醇、乙醇、80%乙醇、乙醇、95%乙醇、无水乙醇。乙醇、无水乙醇。9二苯胺试剂。二苯胺试剂。101mol过氯酸溶液，将过氯酸溶液，将10ml过氯酸过氯酸(70%)用蒸馏用蒸馏水稀释至水稀释至11ml。11实验材料与仪器实验材料与仪器大白鼠肝脏、匀浆器、离心机大白鼠肝脏、匀浆器、离心机5000r/min、量筒、量筒50
37、ml(1)、25ml(1)、10ml(1)、吸管、吸管5ml(2)、水浴锅、真空干燥器。、水浴锅、真空干燥器。【实验步骤实验步骤】1DNA的分离纯化：的分离纯化：（1）将新鲜猪肝用）将新鲜猪肝用0.14mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液洗去血液，剪碎，加入溶液洗去血液，剪碎，加入50ml0.14mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液溶液,置匀浆器中研磨置匀浆器中研磨.待研磨成糊状待研磨成糊状后，将糊状物离心后，将糊状物离心10min(4000r/min)，弃去上清液，沉，弃去上清液，沉淀用淀用0.14mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液洗二、三次。溶液洗二、三次。
38、所得沉淀为脱氧核糖核蛋白制品。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白制品。（2）向上述沉淀物加入）向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液，使总体积为溶液，使总体积为44ml，然后滴加，然后滴加25%SDS溶液溶液3ml，边加边搅拌。加毕，置，边加边搅拌。加毕，置60水浴保温水浴保温10min(不停不停搅拌搅拌)溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。系使核酸与蛋白质分离。（3）加入）加入5molNaCl溶液溶液10ml，使，使NaCl最终浓度最终浓度达到达到1mol/L，搅拌，搅拌10min，加入约一倍体积
39、的氯仿，加入约一倍体积的氯仿-异戊异戊醇混合液，振摇醇混合液，振摇20min，离心，离心10min(4000r/min)。去掉。去掉沉淀，上层清夜徐徐加入沉淀，上层清夜徐徐加入152倍倍95%乙醇，乙醇，DNA沉沉淀即析出，用玻棒慢慢搅动，则淀即析出，用玻棒慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒丝状物即缠在玻棒上。上。（4）将）将DNA粗品置于粗品置于27ml0.15mol/LNaCl-0.0015mol/柠檬酸三钠溶液中，再加入柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml1.5mol/LNaCl-0.0015mol/柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿-异戊醇混合液，振
40、摇异戊醇混合液，振摇10min，离心，离心(4000r/min，10min)，倾出上层液，倾出上层液(沉淀弃去沉淀弃去)，加入，加入1.5倍体积倍体积95%乙醇，乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀(粗粗DNA）。操作步骤）。操作步骤重复处理一次。重复处理一次。（5）将上步得沉淀溶于）将上步得沉淀溶于27ml0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入2倍倍95%乙醇，边加边搅，乙醇，边加边搅，取出丝状取出丝状DNA，依次用，依次用70%、80%、95%及无水乙醇各洗一次
41、，真空干燥。及无水乙醇各洗一次，真空干燥。2、鉴定：用二苯胺法测定、鉴定：用二苯胺法测定DNA实验五实验五 血液中葡萄糖的测定血液中葡萄糖的测定 【实验目的实验目的】（1）理解血糖在生物体内的重要意义。）理解血糖在生物体内的重要意义。（2）掌握）掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。法测定血糖含量的原理和方法。【实验原理实验原理】葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。测定血液中葡萄糖的含量，即血液中葡萄糖的含量。测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术测复杂组分中一种物质的量，根据生
42、化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。【实验试剂与器材实验试剂与器材】1、标准葡萄糖溶液、标准葡
43、萄糖溶液（1）1%（m/V）葡萄糖母液）葡萄糖母液称取葡萄糖称取葡萄糖1.0g，溶于蒸，溶于蒸馏水中，然后用馏水中，然后用100ml容量瓶定容至刻度。容量瓶定容至刻度。（2）标准葡萄糖溶液）标准葡萄糖溶液用移液管吸取用移液管吸取1%葡萄糖母液葡萄糖母液1.0ml，放入，放入100ml容量瓶内，然后定容至刻度。容量瓶内，然后定容至刻度。2、碱性硫酸铜溶液（、碱性硫酸铜溶液（A、B液）液）（1）A液：称取无水碳酸钠液：称取无水碳酸钠35.0g，酒石酸钠，酒石酸钠13.0g及碳及碳酸氢钠酸氢钠11.0g，用蒸馏水溶解，然后用，用蒸馏水溶解，然后用1000ml容量瓶定容量瓶定容至刻度。容至刻度。（2）
44、B液：称取硫酸铜液：称取硫酸铜5.0g，用蒸馏水溶解，然后用，用蒸馏水溶解，然后用100ml容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。碱性硫酸铜（现配现用）。碱性硫酸铜（现配现用）。取取A液液25ml，B液液5ml，混合后，再用，混合后，再用A液定容至液定容至50ml，摇匀。该混合液在，摇匀。该混合液在4冰箱里可保存数日，如果冰箱里可保存数日，如果暴露于阳光下，数小时即失效。暴露于阳光下，数小时即失效。3、酸性钼酸盐溶液、酸性钼酸盐溶液称取钼酸钠称取钼酸钠104.6g，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入500ml容量瓶中，用蒸馏水定
45、容至刻度，然后移入另一容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一较大的试剂瓶中，加溴水较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静置数小时。，摇匀，静置数小时。置于置于1000ml容量瓶中，缓慢加入容量瓶中，缓慢加入85%（V/V）H3PO4225ml，边加边摇匀。再加入，边加边摇匀。再加入25%（V/V）硫酸）硫酸150ml，置暗处至次日，用空气将剩，置暗处至次日，用空气将剩余的溴赶去，加入冰乙酸余的溴赶去，加入冰乙酸75ml，摇匀，加蒸馏水稀释，摇匀，加蒸馏水稀释至至1000ml，贮存于，贮存于棕色瓶中。棕色瓶中。4、10（m/V）钨酸钠溶液）钨酸钠溶液5、0.33mol/L硫酸溶液硫酸溶液
46、6、动物血（家兔心脏取血）、动物血（家兔心脏取血）7、分光光度计、分光光度计8、血糖管、血糖管9、奥氏吸管、奥氏吸管10、水浴锅、水浴锅11、表面皿、表面皿【实验步骤实验步骤】1.无蛋白血滤液的制备无蛋白血滤液的制备先在烧杯中加先在烧杯中加0.8g左右的抗凝剂（草酸钾或草酸钠）左右的抗凝剂（草酸钾或草酸钠），从家兔心脏取血，从家兔心脏取血10ml放入烧杯，振荡摇匀。放入烧杯，振荡摇匀。用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml，缓缓放入，缓缓放入20ml锥形瓶中，加水锥形瓶中，加水7ml，摇匀，血液变成红色透明时加，摇匀，血液变成红色透明时加10钨酸钠钨酸钠1ml，摇匀
47、，再加，摇匀，再加0.33mol/L硫酸，随加随摇，硫酸，随加随摇，加完放置加完放置515min，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于0.1ml全血。全血。2.血糖的测定血糖的测定取具取具25ml刻度的血糖管刻度的血糖管3只，编号，用奥氏吸管吸只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液取无蛋白血滤液2ml，放入第一只血糖管中，于第二只，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml蒸馏水。然后各加蒸馏水。然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，
48、新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮同时置沸水浴内煮6min，取出，在流水中迅速冷却，取出，在流水中迅速冷却，各加入各加入4ml酸性钼酸盐溶液，酸性钼酸盐溶液，1min后以蒸馏水稀释至后以蒸馏水稀释至25ml，混匀，倒入比色杯，用，混匀，倒入比色杯，用722型风光光度计于型风光光度计于420440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）。测标准管和样品管）。3.计算计算按下式计算按下式计算100ml全血中所含的血糖质量（全血中所含的血糖质量（mg）。）。mA1C0A00.1100式中：式中：m：100ml血中所含的糖质量血中所含的糖质量C0
49、：标准葡萄糖溶液浓度：标准葡萄糖溶液浓度A1：样品溶液吸光度：样品溶液吸光度A0：标准溶液吸光度：标准溶液吸光度【注意事项注意事项】1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出壁，容量不准，所以一般放出1ml血液所用的时间不应血液所用的时间不应少于少于1min。2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白
50、变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸与血混合液中加入与血混合液中加入10硫酸硫酸12滴，待变为暗棕色后滴，待变为暗棕色后再滤。再滤。3.血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以实验血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以实验结果可能偏高结果可能偏高20%30%。【思考题思考题】1移液管使用时应注意哪些问题移液管使用时应注意哪些问题?2全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质?实验六实验六 血清中总胆固醇的测定血清中总胆固醇的测定【实验目的实验目的】学习血清胆固醇的检测方法学习血清胆固醇的检测
51、方法。【实验原理实验原理】胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用，胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用，产生紫红色物质，此物质对产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸收，波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。可用比色法定量测定。100ml样品中胆固醇含量在样品中胆固醇含量在400mg之内与吸光度呈良好线性关系。之内与吸光度呈良好线性关系。【实验试剂与器材实验试剂与器材】1、邻苯二甲醛试剂、邻苯二甲醛试剂2、90%醋酸醋酸3、混合酸、混合酸4、标准胆固醇贮液（、标准胆固醇贮液（1mg/ml）5、标准胆固醇应用液（、标准胆固醇应用液（0.1mg/ml）6、人血清、人血清7、试管
52、、试管8、吸管、吸管9、容量瓶、容量瓶10、烧杯、烧杯11、电子分析天平、电子分析天平12、722型（或型（或7220型）分光光度计型）分光光度计【实验步骤实验步骤】1、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制取清洁干燥试管取清洁干燥试管5支，编号，按表加入试剂。支，编号，按表加入试剂。加毕，混匀，静置加毕，混匀，静置10min，以，以550nm波长比色测定，以波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。管号管号试剂试剂01234标准胆固醇应用液标准胆固醇应用液/ml00.10.20.30.4醋酸醋酸/ml0.40.30.20.10
53、邻苯二甲醛试剂邻苯二甲醛试剂/ml0.20.20.20.20.2蒸馏水蒸馏水/ml0.010.010.010.010.01混合酸混合酸/ml4.04.04.04.04.0100ml样品中总胆固醇含量样品中总胆固醇含量/mg0100200300400A550nm2、样品的测定、样品的测定取取2支清洁干燥试管，编号后，按表加入试剂。支清洁干燥试管，编号后，按表加入试剂。显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会升得太高，一般在升得太高，一般在432时，颜色能稳定时，颜色能稳定2h。加毕，混匀，静置加毕，混匀，静置10min，于，于550nm波长比色，以
54、对波长比色，以对照管校正零点，对照标准曲线即知照管校正零点，对照标准曲线即知100ml样品中总胆固醇样品中总胆固醇含量（含量（mg）。）。管号管号试剂试剂对照对照样品样品醋酸醋酸/ml0.40.4血清血清/ml0.010.01邻苯二甲醛试剂邻苯二甲醛试剂/ml00.2无水乙醇无水乙醇/ml0.20混合酸混合酸/ml4.04.0实验七实验七 唾液淀粉酶活性的观察唾液淀粉酶活性的观察 【实验目的实验目的】酶是化学本质为蛋白质的生物催化剂。其活性受酶是化学本质为蛋白质的生物催化剂。其活性受到很多因素的影响，如温度、到很多因素的影响，如温度、pH值以及抑制剂激活剂值以及抑制剂激活剂等。通过本次的实验观
55、察，同学们应该更加深刻的理等。通过本次的实验观察，同学们应该更加深刻的理解理论课上所讲的酶促反应动力学的内容。解理论课上所讲的酶促反应动力学的内容。【实验原理实验原理】在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子，的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子，最终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。它们遇碘呈不同的最终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。它们遇碘呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和分子
56、从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色。红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色。 淀粉在唾液淀粉酶的作用下水解：淀粉紫色糊精红色糊精麦芽糖及少量葡萄糖 遇I2分别呈现：蓝色紫色红色不显色 由于在不同温度，不同由于在不同温度，不同pH，或者在有激活剂或抑制，或者在有激活剂或抑制剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性的影响。的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性
57、的影响。【实验试剂与器材实验试剂与器材】1、试剂、试剂0.5%淀粉溶液淀粉溶液0.3%NaCl溶液溶液0.3%CuSO4溶液溶液碘液碘液2、仪器：恒温水浴锅、仪器：恒温水浴锅【实验步骤实验步骤】1.唾液淀粉酶的制备唾液淀粉酶的制备(1)提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约口（约5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。(2)稀释：将酶提取液用水定容至稀释：将酶提取液用水定容至100mL。作为唾液。作为唾液淀粉酶的样品液。淀粉酶的样品液。（由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的（由于不同人或同一人不同时间收集到
58、的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是活性并不相同，稀释倍数可以是50300倍，甚至超过此倍，甚至超过此范围。）范围。）2.温度对酶活性的影响温度对酶活性的影响取取3支试管，编号后各加入淀粉溶液支试管，编号后各加入淀粉溶液2毫升。将第毫升。将第l、2号试管放入号试管放入37恒温水浴中保温，第恒温水浴中保温，第3号试管放入冰水号试管放入冰水中冷却，中冷却，5分钟后，向第分钟后，向第l号试管中加人煮沸号试管中加人煮沸5一一15分钟的分钟的稀释唾液稀释唾液l毫升；向第毫升；向第2、3号试管加稀释唾液各号试管加稀释唾液各l毫升。毫升。摇匀，摇匀，20分钟后取出分钟后取出3支试管，各加碘溶液支试管，
59、各加碘溶液2滴，混匀，滴，混匀，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液酶活性的影响。并说明温度对唾液酶活性的影响。3.抑制剂和激活剂对酶活性的影响抑制剂和激活剂对酶活性的影响取取3支试管，编号。向第支试管，编号。向第l支试管中加入支试管中加入l%氯化钠氯化钠溶液溶液l毫升，向第毫升，向第2支试管中加入支试管中加入0.1%的硫酸铜溶液的硫酸铜溶液l毫毫升，向第升，向第3支试管中加入蒸馏水支试管中加入蒸馏水l毫升作对照。再向每支毫升作对照。再向每支试管各加入试管各加入0.l%淀粉溶液淀粉溶液3毫升和稀释的唾液毫升和稀释的唾液
60、l毫升。摇毫升。摇匀各管内容物，一齐放入匀各管内容物，一齐放入37恒温水浴中保温，恒温水浴中保温，1015分钟后取出。冷后，各滴入分钟后取出。冷后，各滴入2一一3滴碘溶液，混匀。观察滴碘溶液，混匀。观察比较比较3支试管颜色的深浅。支试管颜色的深浅。【注意事项注意事项】沸水浴中的试管在加入碘液之前一定要在自来水下沸水浴中的试管在加入碘液之前一定要在自来水下冷却。这是因为淀粉与碘液生产的蓝色物质加热会变成冷却。这是因为淀粉与碘液生产的蓝色物质加热会变成无色，如果不冷却而直接加入碘液会使生成的蓝色物质无色，如果不冷却而直接加入碘液会使生成的蓝色物质变为无色，导致得出错误的实验结果。变为无色，导致得出
61、错误的实验结果。【思考题思考题】1.什么是酶的最适温度？有何实践意义？什么是酶的最适温度？有何实践意义？2.什么是酶的最适什么是酶的最适pH？它是否是一个常数？它与哪些？它是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么意义？意义？3.酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？它们各有什么特点？它们各有什么特点？实验八实验八 维生素维生素C的定量测定的定量测定 【实验目的实验目的】1.学习维生素学习维生素C定量测定法的原理和方法。定量测定法的原理和方法。2.进一步熟悉、掌握
62、微量滴定法的基本操作技能。进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能。【实验原理实验原理】维生素维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。抗坏血酸能还抗坏血酸能还原染料原染料2，6二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，血酸。在酸性溶液中，2，6二氯酚靛酚呈红色，被还二氯酚靛酚呈红色，被还原后变为无色。原后变为无色。因此，可用因此，可用2，6二氯酚滴定样品中还原型抗坏二氯酚滴定样品中还原型抗坏血酸。当抗坏血酸全部被氧化后，稍多加一些染料
63、，使血酸。当抗坏血酸全部被氧化后，稍多加一些染料，使墒定液呈谈红色，即为终点。如无其他杂质干扰，样品墒定液呈谈红色，即为终点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所合的还原型抗坏提取液所还原的标准染料量与样品中所合的还原型抗坏血酸量成正比。血酸量成正比。【实验试剂与器材实验试剂与器材】12草酸溶液：草酸草酸溶液：草酸2g，溶于，溶于100m1蒸馏水。蒸馏水。21草酸溶液：溶草酸溶液：溶1g草酸于草酸于100ml蒸馏水。蒸馏水。3标准抗坏血酸溶液。标准抗坏血酸溶液。41HCl溶液。溶液。50.12,6二氯酚靛酚溶液。二氯酚靛酚溶液。6.松针、新鲜蔬菜松针、新鲜蔬菜(辣椒、青菜、
64、西红柿等辣椒、青菜、西红柿等)、新鲜水果、新鲜水果(桔子、柑子、橙、柚等桔子、柑子、橙、柚等)。7.容量瓶容量瓶8.锥形瓶锥形瓶9.微量滴定管微量滴定管10.研钵研钵11.漏斗漏斗【实验步骤实验步骤】1不同样品用不同方法提取不同样品用不同方法提取(1)松针：水洗净，用滤纸吸去表面水分。称取松针：水洗净，用滤纸吸去表面水分。称取05g，放入研钵中，加放入研钵中，加1%HCl溶液溶液5m1一起研磨。放置片刻，一起研磨。放置片刻，将提取液转入将提取液转入50m1容量瓶中。如此反复容量瓶中。如此反复23次。最后次。最后用用1ECt溶液稀释到刻度并混匀，静置溶液稀释到刻度并混匀，静置10分钟，过滤，分钟
65、，过滤，滤液备用。滤液备用。(2)新鲜蔬菜和水果类：水洗净，用纱布或吸水纸吸干新鲜蔬菜和水果类：水洗净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取表面水分。然后称取200g，加，加2草酸草酸100m1置组织搅置组织搅碎机中打成浆状。称取浆状物碎机中打成浆状。称取浆状物50g，倒入，倒入50m1容量瓶容量瓶中以中以2草酸溶液稀释至刻废。静置草酸溶液稀释至刻废。静置10分钟，过滤分钟，过滤(最初最初数数mL滤液弃去滤液弃去)。滤液备用。滤液备用。2滴定滴定(1)标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液10ml(含含01mg抗坏血酸抗坏血酸)置置100ml锥形瓶中，加锥形瓶
66、中，加9ml1%草酸，草酸，微量摘定管以微量摘定管以012，6二氯酚靛酚滴定至淡红色，二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持并保持15秒钟即为终点。由所用染科的体积计算出秒钟即为终点。由所用染科的体积计算出1m1染料相当于多少染料相当于多少mg抗坏血酸。抗坏血酸。(2)样液滴定：样液滴定：准确吸取滤液两份，每份准确吸取滤液两份，每份100m1分分别放人二个别放人二个l00m1锥形瓶内，滴定方法同前。锥形瓶内，滴定方法同前。3计算计算V滴定时所用去染料滴定时所用去染料ml数。数。T=1ml染料能氧化抗坏血酸染料能氧化抗坏血酸mg数。数。W10ml样液相当于含样品之样液相当于含样品之g数。数。【思考题思考
67、题】试述本实验介绍的试述本实验介绍的2，6-二氯酚靛酚滴定法的优缺点。二氯酚靛酚滴定法的优缺点。实验九实验九 脂肪酸的脂肪酸的-氧化氧化 【实验目的实验目的】（1）了解脂肪酸的）了解脂肪酸的-氧化。氧化。（2）通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的）通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定量，掌握测定-氧化的方法及原理。氧化的方法及原理。【实验原理实验原理】根据根据-氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰辅酶酰辅酶A。两分子乙酰辅酶。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在肝可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成脏
68、内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成-羟丁羟丁酸。乙酰乙酸、酸。乙酰乙酸、-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的也能出现酮体。本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘生丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：成碘仿。反应式如下：2NaOH+I2NaIO+NaI+H
69、2OCH3COCH3+3NaOICHI3+CH3COONa+2NaOH剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。NaIO+NaI+2HClI2+2NaCI+H2OI2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaI根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差，可根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。【实验试剂与器材实验试剂与器材】1、0.5%（m/V）淀粉溶液）淀粉溶液2、0.9%（m/V）NaCl溶液溶液3、0.5mol/L丁酸溶液丁酸溶液4、15%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液5、10%氢氧化钠溶液氢氧化钠
70、溶液6、10%盐酸溶液盐酸溶液7、0.1mol/L碘溶液碘溶液8、标准、标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠溶液9、1/15mol/LpH7.6mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液10、恒温水浴、恒温水浴11、微量滴定装置、微量滴定装置12、解剖用具、解剖用具13、玻璃器皿、玻璃器皿【实验步骤实验步骤】 1、肝糜制备、肝糜制备（1）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用0.9%NaCl溶液洗去污血；用滤纸吸去表面的水分。溶液洗去污血；用滤纸吸去表面的水分。（2）称取肝组织）称取肝组织5g置研钵中，加少量置研钵中，加少量0.9%NaCl溶液，溶液，研磨成细浆。再加
71、研磨成细浆。再加0.9%NaCl溶液至总体积溶液至总体积10ml，得肝，得肝组织糜。组织糜。2、酮体生成和沉淀蛋白质、酮体生成和沉淀蛋白质取取50ml锥形瓶锥形瓶2只，编号，并按下表操作。只，编号，并按下表操作。试剂锥形形瓶瓶编号号1号（号（样品）品）2号（号（对照）照）V(1/15mol/LpH7.6mol/L磷酸磷酸缓冲液冲液)/ml33V(0.5mol/L丁酸溶液丁酸溶液)/ml2-V(肝肝组织糜糜)/ml22混匀，置于混匀，置于43恒温水浴内保温恒温水浴内保温1.5hV(15%三三氯乙酸溶液乙酸溶液)/ml33V(0.5mol/L丁酸溶液丁酸溶液)/ml-2混匀，静置混匀，静置15mi
72、n，过滤，滤液分液分别收集于收集于2支支试管中管中混匀后立即用混匀后立即用0.01mol/L标准的硫代硫酸钠溶液滴定剩标准的硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘，滴至浅黄色时，记录滴定余的碘，滴至浅黄色时，记录滴定A瓶与瓶与B瓶溶液所用瓶溶液所用硫代硫酸钠溶液的毫升数，并按下式计算样品中的丙酮硫代硫酸钠溶液的毫升数，并按下式计算样品中的丙酮含量。含量。4、计算、计算肝脏的丙酮含量（肝脏的丙酮含量（mmol/g）=（V对照对照-V样品）样品）CNa2S2O36式中：式中：V对照为滴定对照所消耗的标准对照为滴定对照所消耗的标准Na2S2O3溶液的溶液的体积，以体积，以ml为单位；为单位；V样品为滴定对样品消
73、耗的标准样品为滴定对样品消耗的标准Na2S2O3溶液的体积，溶液的体积，以以ml为单位；为单位；CNa2S2O3为标准为标准Na2S2O3溶液的浓度（溶液的浓度（mol/L）。）。【注意事项注意事项】1、用新鲜肝糜进行实验，确保肝内酶活力。、用新鲜肝糜进行实验，确保肝内酶活力。2、注意滴定终点的控制，保证实验的准确度、注意滴定终点的控制，保证实验的准确度。【思考题思考题】1、为什么说脂肪酸、为什么说脂肪酸-氧化实验的关键是制备新鲜的肝氧化实验的关键是制备新鲜的肝糜糜?2、什么叫酮体、什么叫酮体?为什么正常代谢时产生的酮体量很少为什么正常代谢时产生的酮体量很少?实验十实验十琼脂糖胶电泳法分离乳酸
74、脱氢同工酶琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶 【实验目的实验目的】学习和掌握琼脂糖凝胶电泳法分离乳酸脱氢酶同学习和掌握琼脂糖凝胶电泳法分离乳酸脱氢酶同工酶的原理和方法。工酶的原理和方法。【实验原理实验原理】能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同工酶。同工酶的蛋白结构既有差别，它们的理化性质工酶。同工酶的蛋白结构既有差别，它们的理化性质也就有所差异，因此可用电泳或其他方法将它们分离也就有所差异，因此可用电泳或其他方法将它们分离开来。开来。本实验是用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱本实验是用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱氢酶氢酶5个同工酶（个同工酶（L
75、DH1、LDH2、LDH3、LDH4和和LDH5）。）。【实验试剂与器材实验试剂与器材】1、巴比妥、巴比妥HCl缓冲液（缓冲液（pH8.4，0.1mol/L）2、0.5mol/L乳酸钠溶液乳酸钠溶液3、0.001mol/LEDTANa2溶液溶液4、0.5%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶5、0.8%0.9%琼脂糖染色胶琼脂糖染色胶6、显色液、显色液7、2%醋酸缓冲液醋酸缓冲液8、电泳用缓冲液（、电泳用缓冲液（pH8.6，0.075mol/L）9、人血清、人血清10、水平台，水平仪、水平台，水平仪11、烘箱、烘箱12、电泳槽、电泳槽13、电泳仪、电泳仪14、微量注射器、微量注射器【实验步骤实验步骤】1、琼脂
76、糖凝胶板的制备和电泳、琼脂糖凝胶板的制备和电泳将将0.5%琼脂糖凝胶水浴加热溶化，取琼脂糖凝胶水浴加热溶化，取2ml溶化的凝溶化的凝胶液平浇于一洁净的载玻片上。凝胶凝固后，于此凝胶胶液平浇于一洁净的载玻片上。凝胶凝固后，于此凝胶板一端板一端1/3处，用小刀开一狭长小槽，用滤纸片仔细吸去处，用小刀开一狭长小槽，用滤纸片仔细吸去小槽内液体。小槽内液体。用微量注射器向小槽内加入新鲜血清用微量注射器向小槽内加入新鲜血清1015l，将，将凝胶板放在电泳槽内，两端各以浸有电泳用缓冲液的纱凝胶板放在电泳槽内，两端各以浸有电泳用缓冲液的纱布作盐桥，点样端靠近阴极。电泳布作盐桥，点样端靠近阴极。电泳4060mi
77、n，电压约，电压约100伏。伏。2、显色、显色约于电泳终止前约于电泳终止前10min，将，将0.8%0.9%琼脂糖染色琼脂糖染色胶在水浴中溶化。取此溶化的凝胶胶在水浴中溶化。取此溶化的凝胶0.67ml与显色液与显色液0.53ml及及0.5mol/L乳酸钠溶液乳酸钠溶液0.2ml混匀，立即浇在电泳混匀，立即浇在电泳完毕的凝胶板上，完毕的凝胶板上，37避光保温避光保温1h，即显示出五条深浅，即显示出五条深浅不等的蓝紫色区带。最靠近阳极端区带是不等的蓝紫色区带。最靠近阳极端区带是LDH1，依次为，依次为LDH2、LDH3和和LDH4，LDH5则移向阴极端。则移向阴极端。3、固定与干燥、固定与干燥将显
78、色后的凝胶板浸于将显色后的凝胶板浸于2%醋酸溶液中，醋酸溶液中，2h后取出，后取出，用一干净滤纸覆盖凝胶板上，用一干净滤纸覆盖凝胶板上，50烘烘1.52h，烘干后，烘干后，取去滤纸，背景即透明。取去滤纸，背景即透明。如需定量，可用光密度计测定各区带。如需定量，可用光密度计测定各区带。实验十一实验十一 酪蛋白的制备酪蛋白的制备 【实验目的实验目的】1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。【实验原理实验原理】牛牛乳乳中中的的主主要要的的蛋蛋白白质质是是酪酪蛋蛋白白，含含量量约约为为35g
79、/L。酪酪蛋蛋白白是是一一些些含含磷磷蛋蛋白白质质的的混混合合物物，等等电电点点为为4.7。利利用用等等电电点点时时溶溶解解度度最最低低的的原原理理，将将牛牛乳乳的的pH调调至至4.7时时，酪酪蛋蛋白白就就沉沉淀淀出出来来。用用乙乙醇醇洗洗涤涤沉沉淀淀物物，除除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。【实验试剂与器材实验试剂与器材】1、新鲜牛奶、新鲜牛奶2、95%乙醇乙醇3、无水乙醚、无水乙醚4、0.2mol/LpH4.7醋酸醋酸醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液5、乙醇、乙醇乙醚混合液：乙醇乙醚混合液：乙醇 乙醚乙醚=1 1（V/V）6、离心机、离心机7、抽滤装置、抽滤装置8、精密
80、、精密pH试纸或酸度计试纸或酸度计9、电炉、电炉10、温度计、温度计【实验步骤实验步骤】（一）酪蛋白的粗提（一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加热至牛奶加热至40。在搅拌下慢慢加入预热至。在搅拌下慢慢加入预热至40、pH4.7的醋酸缓冲液的醋酸缓冲液100mL，用精密，用精密pH试纸或酸度试纸或酸度计调计调pH至至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（分钟（3000r/min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化（二）酪蛋白的纯化1.用水洗涤沉淀用水洗涤沉淀3次，离心次，离心10分钟（分钟（3000r/min），弃去），弃
81、去上清液。上清液。2.在沉淀中加入在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗沉淀乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。次，抽干。3.将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。（三）准确称重，计算含量和得率。（三）准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白含量：酪蛋白g/100mL牛乳牛乳式中理论含量为式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。牛乳。【思考题思考题】1.制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？
82、2.试设计另一种提取酪蛋白的方法试设计另一种提取酪蛋白的方法。实验十二实验十二肝脏谷丙转氨酶活力测定肝脏谷丙转氨酶活力测定【实验目的实验目的】掌握谷丙转氨酶的测定方法。掌握谷丙转氨酶的测定方法。【实验原理实验原理】谷丙转氨酶作用于丙氨酸及谷丙转氨酶作用于丙氨酸及-酮戊二酸，生成谷酮戊二酸，生成谷氨酸与丙酮酸。丙酮酸与氨酸与丙酮酸。丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成二二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理硝基苯腙，此物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶的的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。活性。【实验试剂与
83、器材实验试剂与器材】1、标准丙酮酸、标准丙酮酸（现配）（现配）2、谷丙转氨酶底物、谷丙转氨酶底物4，1周周3、0.1MpH7.4PB4、0.02%2,4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液5、0.4MNaOH6、新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）、新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）7、剪刀、剪刀或或组织捣碎机组织捣碎机8、37水浴水浴9、分光光度计（分光光度计（520nm）10、比色皿、比色皿11、计算纸（、计算纸（9cm9cm）【实验步骤实验步骤】1.肝匀浆肝匀浆处理：处理：20g肝先用生理盐水洗净，滤纸吸干水，肝先用生理盐水洗净，滤纸吸干水，再用预冷的再用预冷的0.1MpH7.4PB捣碎，并定容
84、至捣碎，并定容至200ml，供，供全班用。全班用。2.谷丙转氨酶活力的测定谷丙转氨酶活力的测定1）取）取4支试管，标注名称，按照下表操作支试管，标注名称，按照下表操作2）计算酶活力）计算酶活力本法规定：酶在本法规定：酶在37与底物作用与底物作用30分钟，产生分钟，产生2.5g丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。3.计算计算1）每）每ml肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（U/ml） 2）每）每g肝脏谷丙转氨酶活力单位（肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）D=D200/20说明：说明：A：样品：样品A520nmB：对照：对照A520nmS：标准：标准A520nm500：标准丙酮酸浓度：标准丙酮酸浓度2.5：谷丙转氨酶换算单位系数：谷丙转氨酶换算单位系数200：200ml肝匀浆肝匀浆20：20g肝肝【附注附注】1、2,4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性意二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性意的，的，-酮戌二酸也能与酮戌二酸也能与2,4-二硝基苯肼作用而显二硝基苯肼作用而显色。色。2、2,4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白管颜二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白管颜色较深。色较深。
