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1、大肠菌群测定大肠菌群测定小组成员小组成员：金思利金思利杜梦娇杜梦娇叶岳成叶岳成郑文龙郑文龙1.依据依据GB47893-2010，讨论若进行食品中大肠菌群的测定，需准备好哪些，讨论若进行食品中大肠菌群的测定，需准备好哪些材料，且如何进行测定？材料，且如何进行测定？讨论的问题2大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，一般认为该菌群细菌可包括血清学方面并非完全一致，一般认为该菌群细菌可包括大肠杆菌大肠杆菌、产气克雷白氏菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。和阴沟肠杆菌等。大肠菌群是
2、作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌沙门氏菌、志志贺氏菌贺氏菌
3、等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。性。大肠菌群的概述大肠菌群的概述3食品中查出大肠菌群超标4由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即需氧及兼性厌氧、在由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴
4、性无芽孢杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。的定义进行。中国采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制定的行业中国采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制定的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。国家标准国家标准国家标准采用三步法，即乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。国家标准采用三步法，即乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。361培养培养482h
5、，观察是否产气。，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，361培养培养18-24h，观察菌落形态。观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管观察。同时接种乳糖发酵管361培养培养242h，观察产气情况。，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN最大可能数表，报告每最大可能数表，报告每100mL（g）大肠菌群的大肠菌群的MPN值。具体操作参见值。具体操作参见GB4789.
6、394中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准食品卫生食品卫生微生物学检验微生物学检验大肠菌群测定大肠菌群测定检验方法检验方法5原国家商检局制定的行业标准原国家商检局制定的行业标准原国家商检局制定的行业标准采用美国原国家商检局制定的行业标准采用美国FDA的标准方法，用于对出口食的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。品中的大肠杆菌进行检测。推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉肉汤。汤。361培养培养482h，观察是否产气。，观察是否产气。证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（证实试验：将产气管培
7、养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，）肉汤管中，361培养培养482h，观察是否产气。以，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查产气为阳性。查MPN表，报告表，报告1mL(g)样品中大肠菌群的样品中大肠菌群的MPN值。值。具体操作参见具体操作参见SN016992中华人民共和国进出口商品检验行业标中华人民共和国进出口商品检验行业标准准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法检验流程检验流程6大肠菌群的测定的原理v大肠菌群大肠菌群之一群能在37经24h能发酵乳糖，产生气体，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故
8、以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间结指出食品是否有肠道致病菌污染的可能。v三步法：（1）发酵乳糖，产气产酸发酵试验；（2）初发酵阳性管通过伊红美兰平板进行分离；（3）复发酵对分离菌做证实实验。v食品中大肠菌群数系以每100g（或100ml）检样内大肠菌群最近数(themostprobablenumber简称MPN)表示。最近数MPN法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的待检验样品稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释梯度试液接种3或5支。经过培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可以得到原样品中微
9、生物的估计数量。MPN检测方法尤其适用于带菌量、其他方法不能检测的食品，如水、乳制品及其其他食品中大肠菌群的计数。7材料3.1食品样品食品样品：乳、肉、果汁、糕点、发酵调味品及其他食品。乳、肉、果汁、糕点、发酵调味品及其他食品。3.2菌种菌种阳性对照菌阳性对照菌大肠杆菌大肠杆菌 3.3除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌
10、落计数器等。3.43.4培养基和试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（培养基和试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST LST ）肉汤、）肉汤、 煌绿乳糖胆盐煌绿乳糖胆盐（BGLB BGLB ）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ) VRBA ) 、无菌生理盐水或磷酸盐、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、缓冲液、1mol/L1mol/L氢氧化钠（氢氧化钠（NaOH ) NaOH ) 、 1mol/L 1mol/L 盐酸（盐酸（HCI ) HCI ) 。 8第一法大肠菌群第一法大肠菌群MPN计数计数操作步骤操作步骤6.1、样品的稀释、样品的稀释6.1.1、固体和半固体样品：称取固体和半
11、固体样品：称取25g样品，放人盛有样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，的无菌均质杯内，800or/min-10000r/min均质均质1min-2min，或放人盛有，或放人盛有225ml磷酸磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成，制成1:10的的样品匀液。样品匀液。6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中
12、，充分棍匀，制成的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10的样品匀的样品匀液。液。6.1.3、样品匀液的样品匀液的pH值应在值应在6.5-7.5之间，必要时分别用之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（氢氧化钠（NaOH）或或1mol/L盐酸（盐酸（HCI）调节。）调节。6.1.4、用用1ml无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人，沿管壁缓缓注人9ml磷酸磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管
13、或换用管或换用1支支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。的样品匀液。96.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释释样品匀液。每递增稀释1次，换用次，换用1支支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.2、初发酵试验初发酵试验每个样品，选择每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），个适宜的连续稀释
14、度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种）肉汤，每管接种1ml（如接（如接种量超过种量超过1ml，则用双料，则用双料LST肉汤）肉汤）,361培养培养24hZh，观察倒管内是否，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至有气泡产生，如未产气则继续培养至48h2h。记录在。记录在24h和和48h内产气的内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。6.3、复发酵试验复发酵试验用接种环从所有用接种环从所有48h2h
15、内发酵产气的内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物肉汤管中分别取培养物l环，移种于环，移种于煌绿乳糖胆盐煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，）肉汤管中，361培养培养48h2h，观察产气情况。产，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。气者，计为大肠菌群阳性管。6.4、大肠菌群最可能数（大肠菌群最可能数（MPN）的报告）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录表（见附录B)，报告每克（或毫升）样品，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的中大肠菌群的MPN值。值。101112第二法大肠菌群平板计数第二法大肠菌群平板计数8、操作步骤操作步骤8.1、样品的稀释样品的稀释
16、按按6.1进行。进行。8.2、平板计数平板计数8.2.1、选取选取2个个3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1ml。同时分别取。同时分别取1ml生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。8.2.2、及时将及时将15mL-20ml冷至冷至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL-4mlVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置
17、于覆盖平板表层。翻转平板，置于36l培养培养18h-24h。8.3、平板菌落数的选择平板菌落数的选择选取菌落数在选取菌落数在30-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。或更大。8.4、证实试验证实试验从从VRBA平板上挑取平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，肉汤管内，361培养培养24h-48h，观察产气情况。凡，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。群阳性。8.5、大肠菌群平板计数的报告、大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。131415
