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1、第五讲 蛋白质的修饰和表达 重点：重点：蛋白质的分子生物学改造蛋白质的分子生物学改造 重组蛋白的表达重组蛋白的表达难点：难点：蛋白质的分子生物学改造蛋白质的分子生物学改造（五）（五）tRNAtRNA介导的蛋白质工程介导的蛋白质工程n n在蛋白质合成过程中，每个氨基酸都有一个对应在蛋白质合成过程中，每个氨基酸都有一个对应氨酰氨酰tRNAtRNA合成酶和至少一个转移合成酶和至少一个转移RNARNA，氨酰，氨酰tRNAtRNA合合成酶负责把正确的氨基酸加载到对应的成酶负责把正确的氨基酸加载到对应的tRNAtRNA上，上，tRNAtRNA带着氨基酸被其他酶运到核糖体，在核糖体带着氨基酸被其他酶运到核糖
2、体，在核糖体里里tRNAtRNA反密码子与信使的反密码子与信使的RNARNA的密码子匹配，氨基的密码子匹配，氨基酸从酸从tRNAtRNA转移到肽链中，因此转移到肽链中，因此DNADNA的遗传信息被转的遗传信息被转移到蛋白质中的氨基酸序列。移到蛋白质中的氨基酸序列。n n在蛋白质工程中，借助于矫正在蛋白质工程中，借助于矫正tRNAtRNA定点参入非定点参入非天然氨基酸可以提供蛋白质的结构信息，改进天然氨基酸可以提供蛋白质的结构信息，改进蛋白质检测与分离的方法，甚至赋予蛋白质某蛋白质检测与分离的方法，甚至赋予蛋白质某些新的特性。些新的特性。第第二二节节 重组蛋白质的表达重组蛋白质的表达基因工程为目
3、标蛋白质的生产，对其结构功能的研究以及蛋白质及多肽药物的开发在理论和实际应用上开辟了一条崭新的途径。 现阶段蛋白质异源表达的关键问题就是发展克隆基因的表达方法，即找到理想的宿主表达系统。目前常用的表达系统有细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些表达系统各有优缺点。Escherichia colinE.coli常与一些食源性疾病有关，但从人体肠道内分离出来的两常与一些食源性疾病有关，但从人体肠道内分离出来的两种命名为种命名为K-12和和B的良性大肠杆菌菌株却是两种重要实验用菌的良性大肠杆菌菌株却是两种重要实验用菌株。株。大肠杆菌大肠杆菌K-12的基因组的测序工作已于的基因
4、组的测序工作已于1997年完成。年完成。而大而大肠杆菌肠杆菌B菌株自菌株自1918年被分离出来后，在年被分离出来后，在1959年被分离为两类年被分离为两类实验用菌株：一类实验用菌株：一类REL606用于研究长期计划作用；另一类用于研究长期计划作用；另一类BL21(DE3)在医学和工业上用于生产蛋白质。在医学和工业上用于生产蛋白质。n由美国、韩国和法国的科学家组成的研究小组完成了对两种实由美国、韩国和法国的科学家组成的研究小组完成了对两种实验室常用的大肠杆菌验室常用的大肠杆菌(E.coli)菌株基因组的测序工作。这项研菌株基因组的测序工作。这项研究发表在究发表在Journal of Molecu
5、lar Biology杂志上杂志上(2009.10.17)。n基因组大小基因组大小4.6M bp，单个碱基对差异是非随机分布的。单个碱基对差异是非随机分布的。 Yeastn芽殖是酵母最常见的无性繁殖方式，即从细胞壁上产生芽体，形成子芽殖是酵母最常见的无性繁殖方式，即从细胞壁上产生芽体，形成子细胞，一般的酿酒酵母都是芽殖的。酿酒酵母于细胞，一般的酿酒酵母都是芽殖的。酿酒酵母于1996年完成基因组年完成基因组测序。测序。n芽殖酵母和裂殖酵母听起来是近亲，但实际上它们在约亿到亿年芽殖酵母和裂殖酵母听起来是近亲，但实际上它们在约亿到亿年前就分家了，走上不同进化道路。前就分家了，走上不同进化道路。200
6、1年诺贝尔生理学或医学奖获年诺贝尔生理学或医学奖获得者、英国帝国癌症研究基金会的保罗得者、英国帝国癌症研究基金会的保罗纳斯领导的小组完成裂殖酵纳斯领导的小组完成裂殖酵母基因组测序工作。成果发表在自然杂志上。母基因组测序工作。成果发表在自然杂志上。 n裂殖酵母的基因组含有裂殖酵母的基因组含有3条较大的染色体，约条较大的染色体，约1380万个碱基对。分析万个碱基对。分析表明，裂殖酵母只有表明，裂殖酵母只有4824个编码蛋白质的基因，是真核生物中最少个编码蛋白质的基因，是真核生物中最少的，比芽殖酵母少的，比芽殖酵母少1000个左右，甚至比一些细菌还少。有个左右，甚至比一些细菌还少。有50个基因个基因
7、与人类疾病基因很相似，其中约一半与癌症有关。与人类疾病基因很相似，其中约一半与癌症有关。 各种表达系统的优缺点：各种表达系统的优缺点：各种表达系统的优缺点：各种表达系统的优缺点： 细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，但缺乏真核细胞特有的加工后处理，外源蛋白大低，但缺乏真核细胞特有的加工后处理，外源蛋白大低，但缺乏真核细胞特有的加工后处理，外源蛋白大低，但缺乏真核细胞特有的加工后处理，外源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋量表达容易形成包涵体，
8、而且在菌体中表达的外源蛋量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，白，在原核细胞中不稳定，白，在原核细胞中不稳定，白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏易被菌体蛋白酶破坏易被菌体蛋白酶破坏易被菌体蛋白酶破坏。TrxtagHistagthrombinSTagenterokinase目标蛋白目标蛋白硫氧还蛋白标签硫氧还蛋白标签凝血酶凝血酶肠激酶肠激酶 酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本既具有原核
9、细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰。但它蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品译后的修饰。但它蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品译后的修饰。但它蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品译后的修饰。但它蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品产量降低。产量降低。产量降低。产量降低。 昆虫表达系统昆虫表达系统昆虫表达系统昆虫表达系统优点是能较高水平地表达不同动优点是能较高水平地表达
10、不同动优点是能较高水平地表达不同动优点是能较高水平地表达不同动物来源的基因，能够有效地进行蛋白质翻译后的加物来源的基因，能够有效地进行蛋白质翻译后的加物来源的基因，能够有效地进行蛋白质翻译后的加物来源的基因，能够有效地进行蛋白质翻译后的加工。主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为重组工。主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为重组工。主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为重组工。主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为重组病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫4-54-5天后，细胞就裂天后，细胞就裂天后，细胞就裂天后，细胞就裂解，幼虫即死亡
11、。解，幼虫即死亡。解，幼虫即死亡。解，幼虫即死亡。 哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞是生产哺乳动物蛋白质最好的场是生产哺乳动物蛋白质最好的场是生产哺乳动物蛋白质最好的场是生产哺乳动物蛋白质最好的场所，其表达真核基因比其他几种表达系统更优越，所，其表达真核基因比其他几种表达系统更优越，所，其表达真核基因比其他几种表达系统更优越，所，其表达真核基因比其他几种表达系统更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。其缺点是
12、组织细胞有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。其缺点是组织细胞有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。其缺点是组织细胞有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。其缺点是组织细胞培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，成本较高。成本较高。成本较高。成本较高。五、体外翻译系统五、体外翻译系统n n体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表达系统而言的开放表达体系。翻译系统内的表达系统而言的开放表达体系。翻译系统内的组分和翻译条组分和翻译
13、条件件可以根据需要进行适当的改变。可以根据需要进行适当的改变。n n因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内表达系统具有许因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内表达系统具有许多优点如内源性多优点如内源性mRNAmRNA干扰很小，可以同时加入多种基因模板干扰很小，可以同时加入多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用；体外翻译系统可以对基因产物研究多种蛋白质的相互作用；体外翻译系统可以对基因产物进行特异性标记，便于在反应混台物中检测。进行特异性标记，便于在反应混台物中检测。n n目前，体外翻译系统有兔网织红细胞系统、麦胚提取物系统、目前，体外翻译系统有兔网织红细胞系统、麦胚提取物系统、E.coliE.c
14、oli S30 S30系统系统3 3种。种。兔网织红细胞系统 兔网织红细胞用新西兰大白兔制备，通过纯化除去兔兔网织红细胞用新西兰大白兔制备，通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞。网织红细胞裂解后，提取物网织红细胞以外的污染细胞。网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源用微球菌核酸酶破坏内源mRNAmRNA，最大限度降低翻译背景。，最大限度降低翻译背景。裂解物包含蛋白质合成所必须的细胞内组分裂解物包含蛋白质合成所必须的细胞内组分(tRNA(tRNA，核糖，核糖体，氨基酸，起始、延伸、终止因子体，氨基酸，起始、延伸、终止因子) )。 为了使系统更适于为了使系统更适于mRNAmRNA的翻译，
15、兔网织红细胞中还添的翻译，兔网织红细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制，此外还添加了高铁血红素防止翻译起始的抑制，此外还添加了tRNAstRNAs混混合物用于扩大合物用于扩大mRNAmRNA翻译的范围，以及乙酸钾和乙酸镁等。翻译的范围，以及乙酸钾和乙酸镁等。 麦胚提取物的制备麦胚提取物的制备 通过碾磨麦胚，离心去除细胞残渣，通过碾磨麦胚，离心去除细胞残渣，上清液通过层析将抑制翻译的内源氨基酸和植物色素等分离上清液通过层析将抑制翻译的内源氨基酸和植物色素等分离出去。提取物用微球菌核酸酶处理出去。
16、提取物用微球菌核酸酶处理 破坏内源破坏内源mRNAmRNA，最大限，最大限度降低翻译背景。提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的度降低翻译背景。提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统和增加链延伸效率的亚精胺，以及一定量的乙能量生成系统和增加链延伸效率的亚精胺，以及一定量的乙酸镁。酸镁。 麦胚提取物系统可稳定地表达一些在兔网织红细胞系统麦胚提取物系统可稳定地表达一些在兔网织红细胞系统中翻译受到抑制的中翻译受到抑制的DNADNA，比如那些含有低浓度的双链，比如那些含有低浓度的双链mRNAmRNA的模板。此外，麦胚提取物系统缺乏许多在兔网织红细胞中的模板。此外，麦胚提取物系统缺乏许多在兔网织
17、红细胞中翻译需要的转录因子，因此对于表达真核转录因子是一个很翻译需要的转录因子，因此对于表达真核转录因子是一个很好的选择系统。好的选择系统。麦胚提取物系统n nS S3030原核体外翻译系统的原核体外翻译系统的E E. .ColiColi S S3030提取物是提取物是由由OmpTOmpT内切蛋内切蛋白酶和白酶和LonLon蛋白酶缺陷的蛋白酶缺陷的E.ColiE.Coli B B菌株制备，所以在菌株制备，所以在S30S30系统系统中表达基因可以增加产物的稳定性，尤其适用于在体外表达中表达基因可以增加产物的稳定性，尤其适用于在体外表达时易被蛋白酶降解的蛋白质。时易被蛋白酶降解的蛋白质。 S30 S30体外翻译系统也适合表达那些在体内表达时由于宿体外翻译系统也适合表达那些在体内表达时由于宿主编码的抑制酶作用而表达水平低的蛋白质，使其能高水平主编码的抑制酶作用而表达水平低的蛋白质，使其能高水平表达。表达。S30S30系统还可用于转录和翻译调控的研究。此外，系统还可用于转录和翻译调控的研究。此外，S30S30体外翻译系统的应用还包括台成少量标记蛋白质用于蛋白纯体外翻译系统的应用还包括台成少量标记蛋白质用于蛋白纯化中作为示踪物质以及在蛋白质中掺人非天然的氨基酸用于化中作为示踪物质以及在蛋白质中掺人非天然的氨基酸用于研究蛋白质的结构功能。研究蛋白质的结构功能。原核体外翻译系统
