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1、仪器分析第第1111讲讲色谱分析三2主要内容柱外效应；液液分配色谱；离子色谱原理；凝胶色谱原理；3峰展宽因素柱前峰展宽是指由进样及进样器到色谱柱连接管引起的峰展宽。柱后峰展宽主要由检测器流通池体积以及连接管所引起的展宽。液相色谱的柱外效应比气相色谱严重和显著；4液相色谱分离模式一、吸附色谱（adsorption chromatography）原理：基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离的方法。固定相： 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱，活性硅胶最常用。5液固吸附色谱法流动相为
2、液体，固定相为固体吸附剂，根据吸附作用的不同而进行分离的色谱方法称为液固吸附色谱法；液固吸附色谱法中最常用的吸附剂是硅胶，流动相是以烷烃为基的二元或多元溶剂系统；适合分离相对分子量中等的油溶性样品，对具有不同官能团的化合物和异构体具有较高的选择性；6吸附色谱1. 流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等 2. 流动相的选择原则是：极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用弱极性的流动相。3. 混合流动相： 为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值范围很
3、广则使用梯度洗脱7应用1.吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。2. 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象8二、液液分配色谱一般分为：液液色谱、键合相（一般分为：液液色谱、键合相（bonded-phase）色谱）色谱 原理原理主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而在两相中进行不同分配实现不同（分配作用）而在两相中进行不同分配实现分离的液相色谱分离模式分离的液相色谱分离模式 和和GC的差异的差异相同的是：分离的顺序均取决于分配系数，分配相同的是：分离的顺序均取决于分配系数，分配系
4、数大的组分保留值大；不同之处是流动相的性系数大的组分保留值大；不同之处是流动相的性质对质对GC的分配系数影响不大，但对的分配系数影响不大，但对LC的影响很的影响很大。大。9液液分配色谱1.吸附固定相：是通过物理吸附的方法将固定液涂在载体表面，由于流动相的溶解作用或机械力作用，固定相容易流失，导致保留行为的改变，重现性很差，引起分离试样的污染；2.键合固定相：以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去；10键合固定相最常使用的全孔微粒硅胶（310m）是化学键合相硅胶 ，优点是： 硅胶的强度大； 微粒硅胶的孔结构和表面积易人为控制 化学稳定性好 最常用的键合相键型是：
5、硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物 ；111.最常用的“万能柱” “C18柱”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。在反相色谱中发挥着极为重要的作用，可完成高效液相色谱7080的分析任务。2.C18有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，在生物化学分析工作中应用最为广泛。OHOHOHOOO+ C18H37SiCl3SiC18H3712按键合到载体上的官能团可分为1.非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Sila
6、ne）柱或C18柱、C8、C4等2.极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子1314液液分配色谱类型正相色谱法HPLC（normal phase HPLC）： 流动相极性小于固定相极性的称为正相色谱，极性小的组分先流出，极性大的组分后流出；是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC，适合于分离极性化合物反相HPLC（reversed phase HPLC）： 当流动相的极性大于固定相的极性的称为反相色谱，极性大的先流出，极性小的后流出；由
7、非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，适合于分离非极性或中等极性物质如：芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物15液液分配色谱流动相的选择原则样品易溶，且溶解度尽可能大化学性质稳定，不损坏柱子不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收粘度低，流动性好易于从其中回收样品无毒或低毒，易于操作易于制成高纯度，即色谱纯废液易处理，不污染环境1617正相色谱正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80的顺、反 和
8、邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离 在正相色谱柱中，极性弱的先流出18反相色谱1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃常用的流动相组成是：“甲醇H2O”和“乙腈H2O”， 通常优先考虑“甲醇H2O”流动相 2. 反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来 19三、空间排斥色谱（又称凝胶色谱和分子筛色谱）原理：不是按被分离物质在两相中的作用力大小来进行分离，而是按分子尺寸与凝胶孔径大小之间的相对关系来分离的的一种液相色谱分离模式。大分子全排出大分子全排出VR = V0小分子全进入
9、小分子全进入VR = V0 + VS中分子部分进入中分子部分进入VR = V0 + KVS20空间空间排斥色谱凝胶过滤色谱：流动相为水溶液的凝胶色谱；凝胶渗透色谱：流动相为有机溶剂的凝胶色谱；特点：色谱柱不存在失活问题；分离组分有限，难以分析多组分体系；也难以分离分析分子量相近物质；适合测定高分子物质的分子量；21凝胶色谱（高分子材料研究）分离原理 ： 利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。当样品进入色谱柱后，不同大小的样品分子随流动相沿凝胶颗粒外部间隙和凝胶孔穴旁流过，体积大的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻，因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流
10、动相冲洗出来 22不同尺寸的高聚物分子分离过程23离子色谱分类按离子在固定相中的保留机理分类离子色谱法离子交换色谱离子排斥色谱离子对反相分配色谱离子抑制色谱金属配合物分配色谱24离子色谱可以分离的物质无机阴离子: 酸根阴离子无机阳离子: 碱金属,碱土金属,过渡金属有机阴离子: 有机酸,烷基磺酸,多聚磷酸有机阳离子: 有机胺,生物碱,吡啶天然有机物: 糖,醇,酚,水溶性维生素生物物质: 有机磷化合物,核酸,核苷酸,碱基,蛋白质25四、离子色谱法离子性成分在色谱离子性成分在色谱固定相中的分离固定相中的分离离子性成分的检测离子性成分的检测离子色谱分析离子色谱分析=+离子色谱法离子色谱法用离子交换树酯
11、为固定相，电解质溶液为流动相，通常以电导检测器为通用检测器的色谱方法；26固定相离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式：1.一是常见的纯离子交换树脂；2.第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂；3.第三种为大孔径网络型树脂 按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂27流动相离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度28离子色谱仪器构成离子色谱仪器构成EluentEluentPumpPumpColumnColumnDete
12、ctorDetectorPumpingPumpingSeparationSeparationDetectionDetectionRecording(Chromatogram)Recording(Chromatogram)F F- -NONO3 3- -SOSO4 42-2-ClCl- -NONO2 2- -BrBr- -HPOHPO4 42-2-Sample injection valveSuppressorDetection cellInjection29离子交换色谱 （ion exchange chromatography, IEC）IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负
13、电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。SO3H + M+ SO3M + H+ 以离子交换树酯为固定相，以及离子对交换剂具有不同的亲和力而得以分离的色谱方法称为离子交换色谱法离子交换色谱法。30阴离子分析实例阴离子分析实例ColumnColumn：IonPacIonPac AG12A/AS12AAG12A/AS12AEluentEluent：2.7mMNa2.7mMNa2 2COCO3 30.3mMNaHCO0.3mMNaHCO3 3Flowrate
14、Flowrate：1.2mL/min1.2mL/minDetectionDetection：ConductivityConductivity(ASRSRecyclemode)(ASRSRecyclemode)0 02 24 46 68 81010121214141616Retentiontime(min)Retentiontime(min)0 08 8m mSF F- -NONO3 3- -SOSO4 42-2-ClCl- -NONO2 2- -BrBr- -HPOHPO4 42-2-31阳离子分析实例阳离子分析实例0 02 24 46 68 8101012121414Retentiontim
15、e(min)Retentiontime(min)0 01 12 23 34 4NaNa+ +NHNH4 4+ +K K+ +MgMg2+2+CaCa2+2+ S SColumn : IonPac CS12A, CG12AEluent :20 mM Methanesulfonic acidFlow rate : 1.0 mL/minDetection : Conductivity （ （CSRS Recycle mode) 32离子排斥色谱法Ion Exclusion Chromatography分离机理主要源于Donnan膜平衡、体积排阻和分配过程。固定相是具有较高交换容量的全磺化交联聚苯乙烯
16、阳离子交换树脂，这种阳离子交换树脂一般不能用于阳离子的离子交换色谱分离。离子排斥色谱对于从强酸中分离弱酸以及弱酸的相互分离是非常有用的。如果选择适当的检测方法，离子排斥色谱还可以用于氨基酸、醛及醇的分析。 33ColumnColumn ： ： IonPacIonPac ICEAS1ICEAS1EluentEluent ： ： 0.4 mM Octonesulfonic acidFlowrateFlowrate ： ： 1.0 mL/minSuppressorSuppressor ： ： AMMS-ICERegeneratorliquidRegeneratorliquid ： ：5mM TBAO
17、H 50mM H3BO3DetectionDetection ：ConductivityConductivity离子排斥色谱分离实例离子排斥色谱分离实例20202020101010100 0 0 0Retentiontime(min)Retentiontime(min)Retentiontime(min)Retentiontime(min)0 0 0 0 S S S S5 5 5 51 1 1 12 2 2 23 3 3 34 4 4 45 5 5 51. Formic acid2. Acetic acid3. Propionic acid4. Butyric acid5. Valeric a
18、cid34离子对色谱法(Reversed Phase Ion Pair Chromatography)在固定相上涂覆或流动相中加入与溶质离子带相反电荷的离子对试剂，使之与溶质离子形成中性疏水化合物，从而分离离子型或可离子化的化合物的方法称为离子对色谱法。分离机理是：吸附与分配。固定相则是普通HPLC体系中最常用的低极性的十八烷基或八烷基键合硅胶。离子对色谱基本上可以采用通常的反相HPLC的分离体系。35 Column :IonPac NS1、 、NG1 Eluent : 2 mM TBAOH, 24%48% CAN gradient in 10 min Flow rate : 1.0 mL/m
19、in Detection : Conductivity (suppressor type) （ （ASRS MPIC Mode） ） Regenerator : 10 mN H2SO41.Methanesulfonic acid 5.0 g/mL (ppm)2. 1-Propanesulfonic acid 8.63. 1-Butanesulfonic acid 8.74. 1-Hexanesulfonic acid 8.85. 1-Heptanesulfonic acid 8.96. 1-Octanesulfonic acid 8.97. 1-Decanesulfonic acid 9.10
20、Retention time (min)12168S0.0416234578.0反相离子对色谱分离实例反相离子对色谱分离实例36离子抑制色谱法分离机理和离子对色谱法相似，不过，它是通过控制流动相的pH值，使弱酸或弱碱的离解得到抑制，使其以未离解的分子状态在两相间分配或吸附。离子抑制色谱法主要用于有机弱酸弱碱的分析。主要采用通常的反相HPLC的分离体系。37金属配合物离子色谱法使金属离子与显色剂、螯合剂或有机大分子（冠醚）配体形成金属配合物，采用通常的HPLC体系（如反相HPLC）分离和检测。金属离子与小分子配位体形成的稳定配阴离子可在阴离子交换柱上分离;金属配阴（阳）离子与离子对试剂反应后可归
21、入离子对色谱法;主要讨论以离子色谱法。 38影响离子色谱分离的因素温度(流动相,柱,检测器)流动相组成和浓度流动相中的杂质流速39液相色谱样品处理过滤用0.45m或0.22m 滤膜稀稀释与与浓缩除去干除去干扰物物前处理小柱,超滤萃取(固相萃取,液相萃取)离心,盐析在线样品处理40Column:Column: IonPacIonPac AG14, AS14AG14, AS14EluentEluent: :3.53.5 mM mM Sodium carbonate Sodium carbonate1.01.0 mM mM Sodium bicarbonate Sodium bicarbonateF
22、low Rate:Flow Rate: 1.21.2 mL mL /min/minInjInj . Volume:. Volume: 10 10 m m m mL LDetection:Detection:Suppressed conductivity, ASRSSuppressed conductivity, ASRS , ,AutoSuppressionAutoSuppression recycle mode recycle modeSample:Sample:Drinking water from Milpitas, CADrinking water from Milpitas, CAP
23、eaks:Peaks:1.1. FluorideFluoride0.030.03mg/Lmg/L2.2. BicarbonateBicarbonate - - - -3.3. ChlorideChloride3.123.124.4. NitrateNitrate0.150.155.5. PhosphatePhosphate0.040.046.6. SulfateSulfate4.454.45Analysis of Municipal Drinking Water3 3-1-1m m m mS S3 31 1 2 24 45 56 60.50.50 02 24 46 68 81010121214
24、14m m m mS SMinutesMinutes-0.5-0.51 1 2 24 45 53 36 641 EluentEluent: :30mM 30mM Methanesulfonic Methanesulfonic acidacidFlow Rate:Flow Rate:1.0 mL/min1.0 mL/minTemperature:Temperature: 40 40 C CInj. Volume:Inj. Volume: 25 25 m m m mL LDetection:Detection:Suppressed conductivity,Suppressed conductiv
25、ity,CSRSCSRS -ULTRA 4-mm,-ULTRA 4-mm,AutoSuppressionAutoSuppression recycle mode recycle mode Calculated CalculatedPeaks:Peaks:1. Lithium1. Lithium0.002 mg/L (ppm)0.002 mg/L (ppm)2. Sodium 19.7302. Sodium 19.7303. Ammonium3. Ammonium0.0650.0654. Potassium4. Potassium 0.9870.9875. Magnesium5. Magnesi
26、um7.2107.2106. Calcium 18.5446. Calcium 18.5440 05 510101515202025250.100.101.001.001 13 34 4m m m mS S2 25 56 6MinutesCations in Tap Water42液相色谱分离类型的选择43制备型液相色谱利用大直径柱来分离、制备大量纯组分的一种技术，称为制备型液相色谱；特点：分离条件温和；能从复杂体系中高度分离制备大量纯物质；应用：适合标准样品制备，制药工业，生物制品纯化等方面44制备型液相色谱分析型色谱强调分离度和分离速度，进样量大大小于柱容量；分析型色谱强调分离度和分离速度
27、，进样量大大小于柱容量；制备色谱强调纯组分量，而牺牲速度和分离度；制备色谱强调纯组分量，而牺牲速度和分离度；454647毛细管电泳毛细管电泳定义： 以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组份之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离、分析的一类液相分离技术。特点： 分辨率高、分析速度快、质量灵敏度高；所需样品少、成本低；应用范围广：生物大分子、小分子、离子，颗粒等48毛细管电泳原理电泳概念电泳概念在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象。电渗流在高电压作用下，双电层的水合阳离子层引起溶液在毛细管内整体向负极方向的流动。 荷正电物质，中性物质，荷
28、负电物质49毛细管电泳系统基本原理图50毛细管区域电泳 (CZE)毛细管区带电泳的分离原理是：基于样品组分的净电荷与其质量比（荷质比）的差异。荷质比大的先流出；可用于氨基酸，肽，蛋白，离子，对映体和带电物质的分离t为保留时间；n为理论塔板数51毛细管胶束电泳色谱 (MEKC)毛细管胶束电动色谱基于溶质分子按疏水性的不同在水相和胶束相之间分配的差异进行分离检测的技术。疏水性强的溶质保留大，后流出；应用：既能分离中性物质也可以分离带电组份小分子，中性化合物，手性对映体，特别是药物52毛细管凝胶电泳 CGE毛细管凝胶电泳 CGE：是将平板电泳的凝胶移到毛细管中做支持物进行电泳的方式。应用于：蛋白质，RNA，DNA片段分析；53关键提示高效液相色谱液液分配色谱原理正相色谱反相色谱液固吸附色谱离子色谱的种类离子交换色谱离子对色谱离子色谱空间排阻色谱制备色谱高效液相色谱仪结构高压泵剃度洗脱装置进样系统检测器类别和作用紫外光度检测器荧光检测器示差折光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器化学发光检测器54思考题P297-298Q1，Q3，Q5，Q7，Q12The EndThanks!
