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1、基因操作基因操作 Gene manipulationAn overview of DNA cloningSome conception need to knowSome useful technology for gene manipulation Enzymes for DNA cloningVectors一、一、ConceptionDNADNA克隆克隆：将：将目的基因连接到载体上目的基因连接到载体上，形成，形成通常可以在另一宿主细胞内进行复制的通常可以在另一宿主细胞内进行复制的重组重组DNADNA。带有重组带有重组DNADNA的宿主细胞的增殖构成了一群的宿主细胞的增殖构成了一群具有遗传一致
2、性的具有遗传一致性的个体个体，或称为，或称为克隆克隆。这一。这一系列操作过程就称为系列操作过程就称为DNADNA克隆。克隆。科学家从一具科学家从一具4.34.3万年前的猛犸尸体血液中万年前的猛犸尸体血液中提取出高品质提取出高品质DNADNA。猛犸象曾经是世界上最大的象。它身高体壮，有粗壮的腿，脚生四趾，头特猛犸象曾经是世界上最大的象。它身高体壮，有粗壮的腿，脚生四趾，头特别大，在其嘴部长出一对弯曲的大门牙。一头成熟的猛犸，身长达别大，在其嘴部长出一对弯曲的大门牙。一头成熟的猛犸，身长达5 5米，体米，体高约高约3 3米，与亚洲象相近，门齿长米，与亚洲象相近，门齿长1.51.5米左右，虽然身高不
3、高，但身体肥硕，米左右，虽然身高不高，但身体肥硕，因而体重可达因而体重可达6868吨。它身上披着黑色的细密长毛，皮很厚，具有极厚的脂吨。它身上披着黑色的细密长毛，皮很厚，具有极厚的脂肪层，厚度可达肪层，厚度可达9 9厘米。厘米。亚克隆：将已克隆的亚克隆：将已克隆的DNA片段从一个载体转片段从一个载体转移到另一个载体的过程称为亚克隆。移到另一个载体的过程称为亚克隆。亚克隆可用来对较大的克隆片段上较短区亚克隆可用来对较大的克隆片段上较短区断进行仔细研究；断进行仔细研究；将基因转移到能在特定物种中表达的另一将基因转移到能在特定物种中表达的另一载体上；载体上；2、Subcloning(亚克隆亚克隆)含
4、有目标克隆序列的含有目标克隆序列的质粒质粒DNA的提取的提取。用限制性内切核酸酶将质粒用限制性内切核酸酶将质粒酶切酶切成不连续的片段成不连续的片段经琼脂糖经琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳分离片段分离片段纯化目标片段纯化目标片段将目标片段将目标片段连接连接在新质粒载体上，形成新重在新质粒载体上，形成新重 组分子组分子将连接好的质粒将连接好的质粒转化转化某一大肠杆菌菌株某一大肠杆菌菌株转化细菌的转化细菌的筛选筛选重组质粒的重组质粒的分析分析:最常见的亚克隆程序最常见的亚克隆程序:3、DNA文库文库DNA文库：一套文库：一套DNA克隆，每个克隆克隆，每个克隆都是插入了不同片段的载体在宿主中扩都是插入了不同片
5、段的载体在宿主中扩增后的产物。增后的产物。克隆：一个遗传上独立的个体或一群相克隆：一个遗传上独立的个体或一群相同的个体。同的个体。RNA反转录合成反转录合成cDNA后，插入克隆载体构建成；后，插入克隆载体构建成；用用cDNA文库克隆目的基因是有效的，但克隆的仅是编文库克隆目的基因是有效的，但克隆的仅是编码区，而不包含编码区以外的基因组序列。码区，而不包含编码区以外的基因组序列。Genomic libraries（基因组文库）：（基因组文库）：整套由基因组整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。用基因组用基因组DNADNA的随机片段制备成的；
6、的随机片段制备成的；用基因组文库克隆某一基因，效率极低。因为大量用基因组文库克隆某一基因，效率极低。因为大量DNADNA是非编码序列。是非编码序列。 cDNA libraries（cDNA文库）：文库）：细胞全部细胞全部mRNA反转录成反转录成cDNA并被克隆的总和。并被克隆的总和。Host organism/cell: where the plasmids get multiplied and propagated faithfully, which is crucial for DNA cloning.Hosts for DNA cloning vectorProkaryotic host
7、 : E. coli ( most cases)Eukaryotic host : Yeast (Saccharomyces cerevisiae), large fragments of human genome4、Host cell 宿主细胞宿主细胞5、 Vector（载体）（载体）在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进进入受体细胞的入受体细胞的DNA分子叫载体。分子叫载体。 细菌表达载体细菌表达载体酵母表达载体酵母表达载体哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体: Types of vector(载体的类型载体的类型)(1) Cloning vector 克隆载体克
8、隆载体：可以插入、保存外源可以插入、保存外源DNA，并在并在DNA水平上进行操作水平上进行操作大肠杆菌克隆载体：大肠杆菌克隆载体：质粒、质粒、噬菌体噬菌体( M13)、 黏粒黏粒即质粒噬菌体的杂合即质粒噬菌体的杂合体体 细菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC）酵母克隆载体：酵母克隆载体：酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC）(2) Expression vector 表达载体：表达载体：可使外源基因插入可使外源基因插入和表达。具有和表达。具有RNA转录所需的启动子和终止子。转录所需的启动子和终止子。表达载体的结构表达载体的结构E.Coli 表达载体元件表达载体元件 启动基因启动基因P核糖体结
9、合位点核糖体结合位点ORF终止子终止子(3) Integration vectors整合载体：整合载体：允许外源允许外源DNA插入，并在转化后整合到宿主细胞基因组插入，并在转化后整合到宿主细胞基因组中。中。整合是通过质粒与受体细胞中同源序列间发生的同源整合是通过质粒与受体细胞中同源序列间发生的同源重组介导的。重组介导的。细菌整合载体（根癌农杆菌细菌整合载体（根癌农杆菌T T质粒可被用来将质粒可被用来将DNADNA整合到植物基因组中）整合到植物基因组中）酵母整合载体酵母整合载体哺乳动物整合载体：病毒为基础（以病毒的天然感哺乳动物整合载体：病毒为基础（以病毒的天然感染为基础，可用于基因治疗、转基因
10、动物等。）染为基础，可用于基因治疗、转基因动物等。）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。 生物学特征：生物学特征：（1）分子量小：）分子量小：2200kb，多个拷贝。，多个拷贝。（2）复制起点）复制起点：自主复制；：自主复制；（3）编码基因少）编码基因少：其中有（：其中有（抗生素抗性基因抗生素抗性基因） Plasmid(质粒质粒)（4）质粒的空间构型：）质粒的空间构型： 共价闭合环状共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close c
11、ircular DNA呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil） 开环开环DNA（ open circular， ocDNA）一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。 线形线形DNA （ linear ，lDNA） （5）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：率不同：scDNA最快、最快、 L DNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCLLSC: 质粒载体的一般特征：质粒载体的一般特征：独立于宿主基因组的独立于宿主基因组的自主复制自主复制DNADNA；易于易于从宿主细胞
12、中从宿主细胞中分离分离出来；出来；至少包含一个至少包含一个选择标记选择标记，即一个能使含有该载，即一个能使含有该载体的宿主可以从不含该载体的细胞中筛选出来绝体的宿主可以从不含该载体的细胞中筛选出来绝含有含有多克隆位点多克隆位点MCSMCS ；分子量小，拷贝数多。分子量小，拷贝数多。 &质粒的选择标记及其工作原理质粒的选择标记及其工作原理ampr基因编码基因编码内酰胺酶内酰胺酶，降解青霉素类抗，降解青霉素类抗生素如氨苄青霉素。生素如氨苄青霉素。tetA基因编码一种跨膜泵蛋白基因编码一种跨膜泵蛋白，能从细胞内将四，能从细胞内将四环素类抗生素排出。环素类抗生素排出。Kanr 编码氨基糖苷磷酸转移酶编
13、码氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。行修饰，阻断其与核糖体结合作用。 二、二、Technology1.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR技术）技术）2.Plasmid preparation（质粒的提取）质粒的提取）3.Restriction digests（限制性酶切）限制性酶切）4.Agarose gel electrophoresis （琼脂糖琼脂糖凝胶电泳）凝胶电泳）5.DNA ligation（连接）连接）6.Transformation（转化）转化）7.Selection（筛选）筛选）l1.PCR技术就是在体外的小试管中通过酶促反应有
14、选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因DNA的技术。 该技术高效、快捷、特异性好。l 小试管中反应需加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列即微量的总DNA；（2）与欲分离的目的基因两条链的各自5端序列相互补的DNA引物（约20个左右碱基的短DNA单链）；（3）Taq DNA聚合酶；（4）4种核苷酸 4dNTP（即dATP, dTTP, dGTP和dCTP）1985年，Mullis K.发明了一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术;。 1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化； 1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝
15、尔化学奖；1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。The Nobel Prize in Chemistry 1993 PCR技术的诞生与发展技术的诞生与发展 按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3端，Taq DNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的DNA双链 原理：原理：在试管中，利用在试管中，利用DNA聚合酶、一对引物和四种聚合酶、一对引物和四种dNTP，对模板，对模板DNA反复多次地进行复制，从而得到反复多次地进行复制，从而得到大量扩增产物的反应过程。大量扩增产物的反应过程。变性95C延伸72C退火Tm-5CDNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为
16、反应的模板 引物与模板互补结合，形成杂交链 5 Primer 15 Primer 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。N次循环后，得到次循环后，得到2n条条DNAPCR的基本反应步骤1、制备模板、制备模板DNA2、PCR循环反应循环反应3、PCR产物的检测产物的检测（1）电泳分离）电泳分离PCR产物产物（2）染色及检测）染色及检测样本来源：各种组织细胞、培养样本
17、来源：各种组织细胞、培养细胞、寄生虫、微生物、临床标细胞、寄生虫、微生物、临床标本、犯罪现场标本、考古标本。本、犯罪现场标本、考古标本。体内复制与体内复制与PCR技术的区别技术的区别l PCR技术的发明技术的发明PCR的发明是的发明是DNA操作技术的革命操作技术的革命美国美国Kary MullisKary Mullis教授教授 开汽车时的联想开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路逶迤崎岖的山路DNADNA双螺旋双螺旋 行驶的汽车行驶的汽车一小段一小段DNADNA引物引物 1988 1988年发明了年发明了PCRPCR技术技术 19931993年获得诺贝尔奖年获得诺贝尔奖2. Plasmid minip
18、reparation from E. coli小量制备质粒小量制备质粒DNA：含质粒大肠杆菌细胞的含质粒大肠杆菌细胞的培养培养；离心离心菌液菌液收集收集菌体菌体沉淀沉淀；碱裂解：碱裂解：悬浮细胞沉淀，碱裂解，中和悬浮细胞沉淀，碱裂解，中和；酚抽提酚抽提去除蛋白杂质；去除蛋白杂质；乙醇沉淀核酸乙醇沉淀核酸。如何提取自己的DNA?在悬浮缓冲液中在悬浮缓冲液中重悬细胞重悬细胞；溶菌酶溶菌酶降解细菌细胞壁；降解细菌细胞壁；裂解缓冲液中裂解细胞裂解缓冲液中裂解细胞，裂解缓冲液含有，裂解缓冲液含有SDS和和NaOH, SDS的作用是破碎细胞膜及引起蛋白质变性。的作用是破碎细胞膜及引起蛋白质变性。 NaOH
19、的作用是使的作用是使DNA变性变性。中和中和：中和缓冲液含：中和缓冲液含KOAc (pH 5)，其作用是沉淀其作用是沉淀已变性的蛋白质和染色体已变性的蛋白质和染色体DNA及大部分去污剂。超及大部分去污剂。超螺旋质粒螺旋质粒DNA易复性易复性；染色体染色体DNA不能复性。不能复性。: 碱裂解碱裂解染色体线性染色体线性DNA和或和或有缺口的质粒有缺口的质粒DNA变变性后双链分离，难以性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结复性而形成缠绕的结构，与蛋白质构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下在离心的时候沉淀下去。去。 （1）原理：）原理： 溶菌酶溶菌酶能水解菌体细胞壁的
20、主要化学成分肽聚糖中的能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1，4糖苷键。糖苷键。 在碱性条件（在碱性条件（pH8）下有活性。）下有活性。 葡萄糖葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）受机械力（震荡）的作用而降解。的作用而降解。EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止酶的活性，防止DNA被酶降解。被酶降解。 NaOH-SDS NaOH：强碱，提供：强碱，提供pH12的碱性条件，使的碱性条件，使DNA双链变性。双链变性。SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结
21、合成“蛋白蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。酶）变性沉淀。 （2） 所用的试剂作用所用的试剂作用 NaAc-HAc缓冲液缓冲液 冰醋酸把醋酸钠溶液的冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到调到5。用来中和用来中和NaOH变性液，使变性液，使DNA复性。复性。高浓度的高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。等）沉淀。 酚酚-氯仿氯仿 蛋白变性剂，进一步抽提蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。溶液中。 （现多用各种商品化
22、的层（现多用各种商品化的层析柱纯化析柱纯化DNA)。乙醇：用于沉淀乙醇：用于沉淀DNA。 DNA分子以水合状态分子以水合状态“溶于溶于”水里，乙醇能夺去水里，乙醇能夺去DNA分子的分子的水环境。水环境。 centrifugationpelletcellCsCL gradient purification3、 Restriction digestsIdentified in the 1960s and early 1970s Bacterial enzymes which cut DNA into defined and reproducible fragmentsKey discovery w
23、hich allowed the DNA cloning to become a reality20世纪世纪60年代和年代和70年代初鉴定年代初鉴定来自细菌，可将来自细菌，可将DNA酶切成特定的、可酶切成特定的、可再生的片段。再生的片段。其发现及鉴定是实现其发现及鉴定是实现DNA克隆的关键。克隆的关键。qRestriction endonuclease限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶：存在于细菌细胞中的一种识别一存在于细菌细胞中的一种识别一小段对称的小段对称的DNA序列，在识别位点处切割（水解）双链序列，在识别位点处切割（水解）双链DNA骨架的酶。骨架的酶。识别序列：识别序列：48 bp的回文
24、序列；的回文序列；特异性高特异性高：酶切产物：酶切产物：3或或5突出末端或平头末端突出末端或平头末端;新形成的新形成的5-P, 3 OH。4、Gel Electrophoresis带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率反的电极移动，速度称为电泳迁移率 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。正比。 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。摩擦系数
25、主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。 如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同：如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同： 电泳的基本原理电泳的基本原理电泳迁移率主要取决于分子本身的大小和形状。电泳迁移率主要取决于分子本身的大小和形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分分子量越大，移动越慢。子量越大，移动越慢。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 u琼脂糖琼脂糖 一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。 u琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶
26、解，冷却后又琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体凝固成均匀的的胶体“胨胨”。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。 浓度高浓度高 空隙小空隙小 u琼脂糖凝胶的分辨力琼脂糖凝胶的分辨力 Agrose: a polysaccharide derived from seaweed, which forms a solid gel when dissolved in aqueous solution (0.5%-3%)核酸在凝胶中核酸在凝胶中向正极移动？向正极移动？核酸具有很强核酸具有很强的负电性的负电性。检测检测DNA分离、纯化目的
27、分离、纯化目的DNA片段片段分析重组质粒分析重组质粒应用应用凝胶染色凝胶染色 染料染料 溴化乙锭溴化乙锭 Ethidium bromide （EB）原理原理 扁平分子，能插入扁平分子，能插入DNA碱基之间，碱基之间，但不与琼脂糖结合。但不与琼脂糖结合。 EB在在300nm紫外光照射下能紫外光照射下能发红色发红色荧光荧光，即可显示，即可显示DNA泳带在凝胶中所泳带在凝胶中所处的位置处的位置 .荧光强度与荧光强度与DNA含量及大小成正比。含量及大小成正比。 在有在有5末端磷酸基团时，末端磷酸基团时，DNA连接酶可共价连接连接酶可共价连接互补配对的黏性末端或互补配对的黏性末端或平头末端。平头末端。L
28、igase：由由ATP水解提供水解提供能量，将能量，将dsDNA切口处切口处5磷酸与磷酸与3羟基相结合羟基相结合5、DNA ligation6、Transformation感受态细胞感受态细胞(component cell)(component cell)：用：用CaCa2+2+ 溶液溶液处理后易于吸收外源处理后易于吸收外源DNADNA的大肠杆菌细胞的大肠杆菌细胞。用于制备感受态的大肠杆菌细胞是不能表达用于制备感受态的大肠杆菌细胞是不能表达限制修饰系统的特定菌株。限制修饰系统的特定菌株。转化：感受态细胞吸收外源转化：感受态细胞吸收外源DNADNA（质粒）的质粒）的过程。过程。 Transfor
29、mantion efficiency: number of anti-biotic-resistant colonies formed （on a select plate）per microgram (mg) of input plasmid DNA. Ranges from 103/g to more than 108/g. 105/g is adequate for a simple cloning. Heat-shock: After the DNA is uptaken, the cells shall be put at 42oC for 1 min in order to ind
30、uce the suppressed enzymes for cell defending ，which allow the cells to recover from the unusual condition of the transformation progress, and increase the efficiency.转化效率：每毫升用于转化的质粒转化效率：每毫升用于转化的质粒DNA在选在选择平板上所形成的具抗生素抗性的菌落数。择平板上所形成的具抗生素抗性的菌落数。转化率的变动幅度从粗放转化程序转化率的变动幅度从粗放转化程序103/g 精精细转化程序细转化程序108/g。热激热激
31、：42oC热激热激12分钟分钟。诱导与。诱导与DNA修复有修复有关的酶及其它细胞成分的生成。有利于细胞从关的酶及其它细胞成分的生成。有利于细胞从转化过程中的不正常状态下恢复过来，提高转转化过程中的不正常状态下恢复过来，提高转化效率。化效率。7、selectionDistinguish between the recreated vector and religated vector is very important.鉴别环化载体分子与重组质粒是分子克隆中非常重要的步骤。鉴别环化载体分子与重组质粒是分子克隆中非常重要的步骤。双抗生素抗性筛选双抗生素抗性筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选Twin anti
32、biotic resistanceBlue-white screening -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal显色反应显色反应 -半乳糖苷酶能把无色的化合物半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一分解成半乳糖和一个深蓝色的物质个深蓝色的物质5-溴溴-4-氯靛蓝。氯靛蓝。 lacZ编码编码半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，受受lac启动子的调控启动子的调控。当当E.coli 菌株表达菌株表达Lac阻抑物时，则载阻抑物时，则载体上的体上的lacZ 基因由基因由IPTG诱导诱导表达表达，表达形成的酶可利用底表达形成的酶可利用底物物X-gal一种形成蓝色化合物。一种形成蓝色化合物。重组质粒中重组质粒中la
33、cZ 的插入失的插入失活将导致不能形成蓝色菌落。活将导致不能形成蓝色菌落。IPTGIPTG：异丙基异丙基- -D-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷. . 是乳糖的类似物。能是乳糖的类似物。能诱导诱导laclac操纵子的启动转录，操纵子的启动转录，X-gal X-gal ：5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚D D半乳糖苷半乳糖苷Fusion proteinLac融合蛋白：插入片段与融合蛋白：插入片段与lacZ基因具相同的可读框，且是连续的基因具相同的可读框，且是连续的。其产生的融合蛋白是由来自其产生的融合蛋白是由来自lacZ的的N端的几个氨基酸及其紧连着的端的几个氨基酸及其紧连着的由插入片段所编码的
34、蛋白序列组成。由插入片段所编码的蛋白序列组成。组氨酸标签融合蛋白：在表达蛋白组氨酸标签融合蛋白：在表达蛋白ORF的的N端加上一段组氨酸编码端加上一段组氨酸编码序列，以使重组蛋白可通过与序列，以使重组蛋白可通过与Ni色谱柱的特异结合被纯化出来。色谱柱的特异结合被纯化出来。 三、三、Enzyme for DNA cloning1、Alkaline phophatse 碱性磷酸酶碱性磷酸酶removes the phosphate groups from the 5-ends of the vector DNA linearized by a single restriction enzyme to
35、 prevent the self-ligation of the vector DNA upon the followed ligationSingle restriction enzyme directed cloning 去除线性载体分子去除线性载体分子5末端的磷酸基团，使载体末端的磷酸基团，使载体在没有目的片段插入的情况下不能自连成环状，在没有目的片段插入的情况下不能自连成环状，从而降低反应物中载体自身环化的比例。从而降低反应物中载体自身环化的比例。单一酶切指导的单一酶切指导的DNA克隆克隆The use of alkaline phosphate to prevent religat
36、ion of vector molecules 使用碱性磷酸酶防止载体分子自身环化使用碱性磷酸酶防止载体分子自身环化该切口将在该切口将在转化后由细转化后由细胞修复机制胞修复机制修补修补2 限制性内切核酸酶：限制性内切核酸酶：3 DNA连接酶连接酶4 TaqDNA聚合酶：聚合酶：5 多核苷酸激酶：一个依赖多核苷酸激酶：一个依赖ATP的反应，向双链或单链的反应，向双链或单链DNA 或或RNA的的5-OH添加磷酸。添加磷酸。6 末端转移酶：向线性单链或双链末端转移酶：向线性单链或双链DNA或或RNA的的3-OH添添加核苷酸加核苷酸。7 外切核酸酶外切核酸酶III：从线性从线性dsDNA的的3端依次切
37、除核苷酸。端依次切除核苷酸。8 绿豆核酸酶：降解单链核酸，留下完整的双螺旋区段。绿豆核酸酶：降解单链核酸，留下完整的双螺旋区段。9 核酸酶核酸酶S1：降解对应于互补链缺口对面的单链。降解对应于互补链缺口对面的单链。10 RNase A：只降解只降解RNA，而不降解而不降解DNA 的核酸酶。的核酸酶。11 RNase H：降解降解RNA-DNA异源双链中的异源双链中的RNA链的核酸链的核酸酶。酶。四、四、Screening library Searching the genes of interest in a DNA library 通过杂交筛选目标基因通过杂交筛选目标基因放射性或荧光标记的放
38、射性或荧光标记的DNADNA探针是与目的基因序列的某探针是与目的基因序列的某一区段互补或部分互补的一段一区段互补或部分互补的一段DNADNA。从目标基因的蛋白产物序列推测出的一段寡核苷酸从目标基因的蛋白产物序列推测出的一段寡核苷酸来自另一物种中的某一相关基因的一段来自另一物种中的某一相关基因的一段DNADNA或寡核或寡核苷酸苷酸通过目标基因的蛋白质产物来筛选目标基因通过目标基因的蛋白质产物来筛选目标基因对其蛋白产物进行活性鉴定对其蛋白产物进行活性鉴定用特异抗体对其进行用特异抗体对其进行western western 杂交鉴定杂交鉴定DNA-DNA或或DNA-RNA链杂交。用放射性链杂交。用放射
39、性同位素（同位素（32P或或125I）标记的）标记的DNA或或RNA探针探针.hybridization用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品样品Southern blot DNA的制备的制备限制性酶切限制性酶切琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳Southern blot 筛选结果筛选结果 用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测RNA样品。样品。 Northern blot 五、五、 Analysis and uses of cloned DNA克隆克隆DNA的鉴定过程包括测定重组的鉴定过程包括测定重组DNA分子分子的各种特性，如大小、限制图谱、核苷酸序列、的各种特性，如大小、
40、限制图谱、核苷酸序列、基因的位置及方向。基因的位置及方向。纯纯DNA样品的制备样品的制备是克隆是克隆DNA鉴定的第一步。鉴定的第一步。Characterization（鉴定鉴定 ）of cloned DNAThe size of the cloned DNA can be determined by restriction digestion & agarose gel electrophoresis with the molecular weight marker1 应用限制酶切、琼应用限制酶切、琼脂糖凝胶电泳及分子脂糖凝胶电泳及分子量标准可确定克隆量标准可确定克隆DNA片段的大小。片段的大
41、小。2、Restriction MappingThe restriction map of the recombinant DNA can be built By digestion with restriction enzymes, alone and inconbinations, By partial digestion of end-labeled DNA using polynucleotide kinase or terminal transferase，and sizing of fragments producedthe restriction map can indicati
42、ng the clevage position and fragment size.限制图谱的构建：限制图谱的构建：用一种或两种以上的限制酶对重组用一种或两种以上的限制酶对重组DNA分子进分子进行酶解；行酶解；用限制酶对末端标记的用限制酶对末端标记的DNA片段进行部分酶解片段进行部分酶解,并测定所生成片段的大小；并测定所生成片段的大小；限制图谱可标明重组限制图谱可标明重组DNA分子的酶切位点和片段分子的酶切位点和片段大小。大小。Combinational enzyme digestionPartial digestionqLabeling nucleic acid5 end labeling
43、:require polynucleotide kinase (多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶)to add a phosphate to nucleic acid with a free 5-OH,which can be created by dephosphoprylation using alkaline phosphatase (碱性磷酸酶碱性磷酸酶). The external phosphate of ATP is the source of the label.3end labeling :require the terminal transferase (末端转移酶末端转移酶)
44、to add one or more nucleotides to the 3end of nucleic acid.Uniform labeling: require polymerases（聚聚合酶合酶） to synthesize a complete labeled strand. 5-末端标记末端标记:可用可用多核苷酸激酶多核苷酸激酶将具放射活将具放射活性的磷酸加到具有性的磷酸加到具有游离游离5 OH的核酸上。游的核酸上。游离的离的5 OH可由可由碱性磷酸酶碱性磷酸酶去磷酸化产生。去磷酸化产生。ATP的的-磷酸磷酸是用来标记的标记源。是用来标记的标记源。3-末端标记末端标记:可用可用
45、末端转移酶末端转移酶向核酸的向核酸的3端端加上一个或多个核苷酸进行。加上一个或多个核苷酸进行。均匀标记均匀标记：需用：需用聚合酶完成一条完整的被标聚合酶完成一条完整的被标记链记链。3、Nucleic acid sequencingqDNA sequencingMaxam and Gilbert chemical methodSangers enzymic method qSangers enzymic method Dideoxynucleotides as chain terminators produces a ladder of molecules generated by polyme
46、rase extension of primer；then PAGE separates the molecular。 The sequencing primer is annealed to a ssDNA template molecule ； a DNA polymerase extends the primer using dNTP. The extension reaction is split into four and each quarter is terminated separatly with one of the four specific ddNTP； the fou
47、r samples are analyzed by PAGE.qSanger的酶法的酶法：原理：原理：双脱氧核苷酸作为链终止试剂，通过聚合双脱氧核苷酸作为链终止试剂，通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子。酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子。测序引物测序引物与与单链单链DNA模板模板结合后。结合后。DNA聚合酶聚合酶用用dNTP延伸引物。延伸反应分成四延伸引物。延伸反应分成四组，每一组分别用四种组，每一组分别用四种ddNTP中的一种来进行终中的一种来进行终止。止。再用再用PAGE分析四组样品分析四组样品。为什么为什么ddNTP可终止可终止链的延伸反应链的延伸反应？2，3双脱氧核酸在双脱
48、氧核酸在脱氧核糖上没有聚合酶脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需的延伸链所需的3OH基团。基团。Sanger反应需要的反应需要的组分组分？DNA模板；模板；DNA聚合酶；聚合酶；标记的测序引物；标记的测序引物；dNTP;ddNTP.qSequence databasesequence database online美国生物工程信息中心（美国生物工程信息中心（GenBank) http:/www.ncbi.nlm.nih.gov基因组序列数据库（基因组序列数据库（GSDB:Genome sequence database) http:/www.ncgc.org:80/gsdb欧洲分子生物学研究所（欧洲
49、分子生物学研究所（EMBL ) http:/www.ebi.ac.uk日本日本DNA数据库（数据库（DDBJ:DNA data bank of Japan) http:/www.nig.ac.jpsequence database software (DNA club、GCG、DNAman) 以以克克隆隆和和重重组组DNA为为核核心心的的技技术术即即基基因因工工程程技技术术，又又称称为为重重组组DNA技术。技术。 重重组组DNA技技术术的的重重大大突突破破带带动动了了现现代代生生物物技技术术的的兴兴起起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。并很快产生了许多生命科学的高技术产业。克隆克隆(cl
50、one)-无性繁殖（系）无性繁殖（系）分子克隆分子克隆 DNA的无性繁殖技术的无性繁殖技术 （从（从1973年年DNA重组）重组） 重组重组DNA技术包括了基因克隆为主的一系列的分子生技术包括了基因克隆为主的一系列的分子生物学操作步骤，实现不同物种间基因的转移。物学操作步骤，实现不同物种间基因的转移。 从研发到进入市场，需要的周期长，至少从研发到进入市场，需要的周期长，至少5年以上年以上基因工程技术是现代生物技术的基础基因工程技术是现代生物技术的基础重组重组DNA操作的一般步骤：操作的一般步骤：1）获得需要的）获得需要的目的基因目的基因（又称外源基因）；（又称外源基因）；2）目的基因在限制性内
51、切酶和连接酶作用下与载体目的基因在限制性内切酶和连接酶作用下与载体连接，形成新的重组连接，形成新的重组DNADNA分子（分子（克隆和筛选克隆和筛选）；）； 3）转化或转染转化或转染：用重组的用重组的DNA分子转化受体细胞，分子转化受体细胞，使之进入受体细胞并能在受体细胞中复制和遗传；使之进入受体细胞并能在受体细胞中复制和遗传；4）对转化子即获得外源基因的受体细胞进行对转化子即获得外源基因的受体细胞进行筛选和筛选和鉴定鉴定；( (阳性克隆阳性克隆) )5）对获得外源基因的细胞或生物体通过发酵、细胞）对获得外源基因的细胞或生物体通过发酵、细胞培养、养殖或栽培等，最终获得所需的遗传性状培养、养殖或栽
52、培等，最终获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。或表达出所需要的产物。重组重组DNA技术技术-基因工程图示基因工程图示第一步：获取目的基因第一步：获取目的基因基因工程基本步骤：基因工程基本步骤：第二步：目的基因与运载体结合第二步：目的基因与运载体结合第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞第四步第四步: : 目的基因的表达和检测目的基因的表达和检测？如何让大肠杆菌生产人胰岛素？如何让大肠杆菌生产人胰岛素？从细胞中分离从细胞中分离出出DNADNA限制酶截取限制酶截取DNADNA片断片断分离大肠杆菌分离大肠杆菌中的质粒中的质粒 DNA DNA重组重组用重组质粒转用重组质粒转化大肠杆菌化大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因克隆大量基因
