讲义3：微生物基本操作规范采样和取、制样

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1、食品微生物检验食品微生物检验标准操作根底培训标准操作根底培训3 采样和取、制样采样和取、制样福建出入境检验检疫局技福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验术中心食品所微生物实验室室2021.05 主要内容：主要内容： 1清洗、消毒和清洗、消毒和灭菌操作菌操作 2培养基的制培养基的制备 3采采样和取、制和取、制样 4接种、接种、别离离纯化化 5制片、染色及制片、染色及显微微观察察 6实验室平安根底知室平安根底知识 3.采样和取、制样样品的采样和取、制样是食品微生物检验的重要组成局部。要得到准确的检测结果，必需正确掌握采样技术、样品传递、样品保存方法和样品的制备技术，保证样品在从采样到制样整个

2、过程中的一致性。如果样品的采取、运送、保存或制备过程中操作不当，或者样品不具有代表性，就会使实验室的微生物检验结果毫无意义。对采样人员和制样人员提出了很高的专业要求，既要保证样品的代表性和一致性，又要保证整个微生物检验过程在无菌操作的条件下完成。3.1 采采 样样 采样是指在一定质量或数量的产品中，取一个或多个代表性样品，用于微生物检验的过程。 样品必须对采样的整个产品或批量具有代表性。样品的大小应能满足在需要时进行重复分析的需要。3.1.1 采样准备工作1.采样工具 采样工具要到达无菌的要求。对采样工具和一些试剂材料应提前准备、灭菌。1开启容器的工具：剪刀、刀子、开罐器、钳子等。双层纸包裹灭

3、菌121 ，15min，枯燥洁净的环境中保存2个月。2样品采集工具：灭菌的铲子、勺子、取样器、镊子、锯子、刀子、剪子、压舌板、木电钻、打孔器、金属试管和试子等。3取样容器：灭菌的广口瓶或细口瓶，聚乙烯袋瓶、金属试管或类似的密封金属容器。最好不使用玻璃容器，运输中易碎。4温度计：-20 100 ，温度间隔1 。最好使用金属或电子温度计。使用前在70%75%乙醇溶液或次氯酸钠浓度不小于100mg/L中浸泡消毒不小于30s。5)消毒剂： 70%75%乙醇溶液、中等浓度100mg/L次氯酸钠溶液等。6标记工具：标签纸不干胶标签纸、油性或不可擦拭记号笔。7样品运输工具：便携式冰箱或保温箱。8天平：最大量

4、程为2000g，感量为0.1g。9搅拌器和混合器：必要时配备带有灭菌灌的搅拌器或混合器。10稀释液：灭菌的磷酸盐缓冲液、0.1%蛋白胨水、生理盐水以及其他稀释液如脑心浸液肉汤、M肉汤、LB肉汤等。11防护用品：对样品的防护。即保护生产环境、原料和成品等不会在取样过程中被污染，同样也保护样品不被污染。工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。事先消毒灭菌或使用一次性无菌物品)。应根据不同的样品特征和采样环境，对采样物品和试剂进行事先准备和灭菌等工作。实验室的工作人员进入车间采样时，必须更换工作服，防止将实验室的菌体带入加工环境，造成加工过程的污染。2.采样方案 微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结

5、果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的采样方案，其次使用正确的采样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。一般说来，进出口贸易合同对食品采样量有明确规定的，按合同规定采样；进出口贸易合同没有具体采样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定采样方案。 目前的采样方案多为ICMSF推荐的采样方案和随机采样方案。无论采取何种方法采样，每批货物的采样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，采样数量应适当增加，最低不少于8件。1)采样的术语批量货

6、物：数量确定的货物，品质必须均匀一致。抽检货物：从批量货中的一个位置取出的少量货物。混合货样：条件允许，从某一特定批量采样、混合， 即为混合货样，亦即大样。样品单位：从监督总体中抽取用于检验的样品中的单 位产品。样品量：样品中所包含的样品单位数。合格判定数：在计数采样检查中，对接收批的样品允 许出现的缺陷数或不合格品数的上限 值，合格判定数又称可接受数。批：一批产品中或特定阶段或时间内代表相同质量样 品的单元数。随机采样：在一批产品中，每个样品或单元都有同样被选择的时机。这种采样方法被称为随机采样。采样时常需要查阅随机数字表。代表性样品：广义上讲是指能够代表一个批的样品，而不是仅代表其中的一局

7、部。要获得代表性样品需要以下四个条件：确定整批产品的采样点；建立能够代表整个产品特征的采样方法；选择样品大小；规定采样的频率。2采样原那么(1)根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案;(2)应采用随机原那么进行采样，确保所采集的样品具有代表性;(3)采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染；(4)样品在保存和运输的过程中，应采取必要的措施防止样品中原有微生物的数量变化，保持样品的原有状态。 3采样方案的类型 依据GB 4789.1-2021?食品平安国家标准 食品微生物学检验 总那么?(1)类型 采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m

8、值，三级采样方案设有n、c、m和M值。 n：同一批次产品应采集的样品件数； c：最大可允许超出m值的样品数； m：微生物指标可接受水平的限量值； M： 微生物指标的最高平安限量值。 注1： 按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许有c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。 注2： 按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允许有c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。 例如：n=5，c=2，m=100 CFU/g，M=1 000 CFU/g。 含义是从一批产品中采集5个样品，假设5个样品的

9、检验结果均小于或等于m值100 CFU/g，那么这种情况是允许的； 假设2个样品的结果X 位于m值和M值之间100 CFU/g 1 000 CFU/g，那么这种情况也是不允许的。 2各类食品的采样方案 按相应产品标准中的规定执行。3食源性疾病及食品平安事件中食品样品的采集 由工业化批量生产加工的食品污染导致的食源性疾病或食品平安事件，食品样品的采集和判定原那么按以上的1和2执行。同时，确保采集现场剩余食品样品。由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食源性疾病或食品平安事件，食品样品的采集按GB14938中卫生学检验的要求，以满足食源性疾病或食品平安事件病因判定和病原确证的要求。 4ICMSF采样

10、方案简介 国际食品微生物标准委员会ICMSF所建议的采样方案是目前世界各国在食品微生物工作中常用的采样方案。ICMSF提出的采样根本原那么根据： a)各种微生物本身对人的危害程度各有不 同。 b食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：降低危害度；危害度未变；增加危害度，来设定采样方案并规定其不同采样数。ICMSF的采样方法 有些实验室在每批产品中，仅采一个检样进行检验，该批产品是否合格，全凭这个检样来决定。ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。 ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有n、及m

11、值，三级法那么有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。1二级采样方案 自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，那么为不合格品。检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。 例如生食海产品鱼的副溶血性弧菌标准为n=5，c=0，m=102，n=5即采样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有菌落数超过m值的检样，此批货物为合格品。2三级采样方案 设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，那么为不

12、合格。 例如：冷冻生虾的细菌总数标准n=5，c=3，m=101，M=102，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果允许3个检样的菌落数是在m和M值之间。如果有3个以上检样的菌落数是在m和M值之间或一个检样菌落数超过M值者，那么判定该批产品为不合格品。3ICMSF对食品中微生物的危害度分类与采样方案说明 为了强调采样与检样之间的关系，ICMSF已经阐述了把严格的采样方案与食品危害程度相联系的概念ICMSF，1986。在中等或严重危害的情况下使用二级采样方案，对健康危害低的那么建议使用三级采样方案。 ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的

13、。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。下面结合表1加以说明。表表1 1、ICMSFICMSF按微生物的危害度及食品处理进行情况分类按微生物的危害度及食品处理进行情况分类 级别 危害程度 对象微生物 食品经不同处理后的危害度 减少（加热） 无变化（冷冻品立刻进食） 增加危害度（未加热吃到吃前还有一段时间） 三级方案 1.食品的保藏2.轻度间接指标菌3.中度程度局部传播菌落总数大肠菌群、大肠杆菌金黄色葡萄球菌（指标菌）金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆菌产气荚膜梭菌 例1n=5 c=3例4n=5 c=3例7n=5 c=2 例2n=5 c=2例5n=5 c=2例8n=5 c

14、=1 例3n=5 c=1例6n=5 c=1例9n=10 c=1 二级方案 4.中度程度广泛传播5.严重程度 沙门氏菌副溶血性弧菌致病性大肠杆菌肉毒梭菌、霍乱弧菌伤寒沙门氏菌副伤寒沙门氏菌 例10n=5 c=0例13n=15 c=0例11n=10 c=0例14n=30 c=0例12n=20 c=0例15n=60 c=0 注：1.表中“减少系指食品经加热杀死污染的细菌。 2.“无变化系指微生物数不增减例如冷冻食品或枯燥食品。 3.“增加系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。 4.n：一批产品采样个数。c：该批产品的样品菌落数中，超过限量的 检样数。 根据表1中15种情况的举例，1-3可

15、用三级法，4-5可用二级法来判定是否合格。 考虑到以上15种情况，分别设定不同的取样数及检样污染数，在1-9例中检样需采5个n=5，而污染检样数设定为c=3，2，1。在10-15例用二级法那么不得检出该致病菌c=0。例如冷冻食品，细菌数按例2，大肠菌按例5，金黄色葡萄球菌按例8，沙门氏菌按例11的二级法判定。 对食品处理应酌情考虑，例如生肉火腿中的金黄色葡萄球菌，被腐败菌所抑制，不易发生食物中毒，适用例7和例8。烹调加工后的熟肉，对腐败菌没有抵抗力，那么易发生食物中毒，适用例9。加热盐腌的火腿，水分活性为0.86以下，金黄色葡萄球菌有增殖的可能性，因此适用例9。沙门氏菌水活性在0、94以下不能

16、繁殖，适用例11，如上所述，应根据各种食品的危害度进行设定。 ICMSF方法是以二级法、三级法和抽样的概念为根底，再将微生物的知识加进来，那么可以提出各种食品的微生物标准。如表2。 为了平安，冷冻生虾加热吃，减少危害度适用例1、4、10。冷冻加工虾，为了不加热就食，在解冻中有增强危害度的可能性，适用例3、6、9、12，对象微生物特别指定金黄色葡萄球菌肠毒素，两者虽菌数限量是相同的，但情况有所不同，分别适用c=3，c=1，因此不依靠菌数限量，而用合格率来控制。表表2 2、ICMSFICMSF虾的微生物标准虾的微生物标准食品名称 检查项目 例 级别 n c 菌数限量/g m M 冷冻生虾冷冻烹调虾

17、 细菌数大肠菌群金黄色葡萄球菌副溶血性弧菌细菌数大肠菌群金黄色葡萄球菌副溶血性弧菌 1441036912 33323332 55555555 33301110 10641031021064103102 10740021031074002103 注：n：一批产品采样个数。c：该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。m：合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。M：附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。5随机采样方案在现场采样时，可利用随机采样表进行随机采样。随机采样表SN 0330-1994?出口食品中微生物检验通

18、那么?系用计算机随机编制而成，包括一万个数字。其使用方法如下：a.先将一批产品的各单位产品如箱、包、盒等按顺序编号。如将一批600包的产品编为1、2600。b.随意在表上点出一个数。查看该数字所在的行和列。如点在第48行、第10列的数字上。c.根据单位产品编号的最大位数如A1，最大为三位数，查出所在行的连续列数字如A2所点数为第48行、第10、11和12列，其数字为245，那么编号与该数相同的那一份单位产品，即为一件应抽取的样品。d.继续查下一行的相同连续列数字如按A3、即第49行的第10、11和12列的数字，为608。该数字所代表的单位产品为另一件应抽取的样品。e.依次按A4所述方法查下去。

19、当遇到所查数超过最大编号数量如第50行的第10、11和12列的数字为931、大于600那么舍去此数，继续查下一行相同列数，直到完成应抽样品件数为止。采样方法 确定了采样方案以后，采样方法对采样方案的有效执行和保证样品的有效性代表性至关重要。 采样必须遵循无菌操作程序，采样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必需清洁、枯燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。 采样全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。 确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。各类食品的采样方法 采样应遵循无菌操作程序，采样工具和容器应无菌

20、、枯燥、防漏，形状及大小适宜。1即食类预包装食品：取相同批次的最小零售原包装，检验前要保持包装的完整，防止污染。 2非即食类预包装食品 ： 原包装小于500 g的固态食品或小于500 mL的液态食品，取相同批次的最小零售原包装；大于500 mL 的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其到达均质后分别从相同批次的n个容器中采集5倍或以上检验单位的样品；大于500g的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的几个不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求。 3散装食品或现场制作食品： 根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用无菌采

21、样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放入无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求。4食源性疾病及食品平安事件的食品样品 采样量应满足食源性疾病诊断和食品平安事件病因判定的检验要求。3.2样品的标记和运输样品的标记和运输 应对采集的样品进行及时、应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，采样人应准确的记录和标记，采样人应清晰填写采样单包括采样人、清晰填写采样单包括采样人、采样地点、时间、样品名称、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件来源、批号、数量、保存条件等信息。等信息。 样品的标记样品的标记 1所有盛样容器必须有和所有盛样容器必须有和样品一致的标记。在标记上应样

22、品一致的标记。在标记上应记明产品标志与号码和样品顺记明产品标志与号码和样品顺序号以及其他需要说明的情况。序号以及其他需要说明的情况。标记应牢固，具防水性，字迹标记应牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。不会被擦掉或脱色。2当样品需要托运或由当样品需要托运或由非专职采样人员运送时，必须非专职采样人员运送时，必须封识样品容器。封识样品容器。样品的保存和运送 1采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验。运输时应保持样品完整。如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件下贮存。例如冷冻样品应存放在-15以下冰箱或冷藏库内；冷却和易腐食品存放在0-4冰箱或冷却库内；其他食品可放在常温冷暗处

23、。2运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。必要时可于途中补加冷却剂或冷冻剂。3如不能由专人携带送样时，也可托运。托运前必须将样品包装好，应能防破损，防冻结或防易腐和冷冻样品升温或融化。在包装上应注明“防碎、“易腐、“冷藏等字样。4作好样品运送记录，写明运送条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由运送人签字。 保存方法 联合国粮农组织 (FAO)推荐的样品保存方式可作参考。3 样品的制备样品的制备3.3.1 样品检验样品检验 实验室样品的制备是微生物检验的实验室样品的制备是微生物检验的重要环节，是获得较高准确性和良好重要环节，是获得较高准确性和

24、良好检验结果的根底。检验结果的根底。样品处理样品处理 1实验室接到送检样品后，应认真核实验室接到送检样品后，应认真核对登记，确保样品的相关信息完整并对登记，确保样品的相关信息完整并符合检验要求。符合检验要求。 2实验室应按要求尽快检验。假设不实验室应按要求尽快检验。假设不能及时检验，应采取必要的措施保持能及时检验，应采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品中目标微样品的原有状态，防止样品中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化。生物因客观条件的干扰而发生变化。 3冷冻食品应在冷冻食品应在45以下不超过以下不超过15min，或，或25不超过不超过18h解冻后解冻后进行检验。进行检验。检验方法的选

25、择 GB 4789.1-2021要求: 1应选择现行有效的国家标准方法。 2食品微生物检验方法标准中对同一检验工程有两个及两个以上定性检验方法时， 应以常规培养方法为基准方法。 3食品微生物检验方法标准中对同一检验工程有两个及两个以上定量检验方法时， 应以平板计数法为基准方法。 GB/T 4789.1725-2003中分别规定了肉与肉制品、乳与乳制品、蛋与蛋制品、水产食品、清凉饮料、调味品、冷食菜和豆制品、糖果和糕点及果脯、酒类的样品的制备方法。 以上标准规定使用的稀释剂均为无菌蒸馏水或生理盐水，大多数产品标准也主要使用这两种稀释剂，而且对待检样品的制备方式相当单一。反映出我国相关标准比较滞后

26、，缺乏先进性，微生物样品制备的方法在实际应用中针对性差，操作性不强。 由于食品种类繁多，在实际微生物检验中尽可能采用统一的样品制备方法。对于许多特殊产品，由于产品本身的物理状态如干品、粘稠度高的产品等、样品中抑制剂存在如大蒜制品、洋葱制品、咸鱼等或酸性等原因，需要采用特殊的样品制备方法。包括： 1调整食品稀释液的pH至中性； 2对于含高抑制物质成分的产品如大蒜制品、洋葱制品等或所含微生物受损的产品如酸性食品、盐渍食品、干制食品等，使用缓冲蛋白胨水或其他稀释剂如D/E中和肉汤、脑心浸液肉汤等； 3对于低水分活度的食物，需要采取特殊复水程序；4调整适当温度和静置时间，以利于可可粉、明胶、奶粉等样品

27、的悬浮；5对于来自食物加工或贮存过程中的受损微生物，需要采取特殊复苏程序；6某些产品如谷物和或目标菌如酵母菌和霉菌的特殊均质程序及均质时间；7对于高脂肪食品，使用外表活性剂如1g/L到10g/L聚山梨醇酯80，促进悬浮过程中的乳化作用。3.3.2 稀释液的选择稀释液的选择常用和特殊稀释液常用和特殊稀释液 常用稀释液包括：常用稀释液包括：0.85%生理盐生理盐水、缓冲蛋白胨水水、缓冲蛋白胨水BPW、0.1%蛋蛋白胨水、磷酸盐缓冲溶液、无菌蒸馏白胨水、磷酸盐缓冲溶液、无菌蒸馏水等。水等。 特殊稀释液包括：特殊稀释液包括：D/E中和肉汤、中和肉汤、LB肉汤、肉汤、M肉汤等。肉汤等。 最适宜的稀释液应

28、该通过一系列最适宜的稀释液应该通过一系列的试验得到，所选择的稀释液应该具的试验得到，所选择的稀释液应该具有最高的复苏率。有最高的复苏率。3.3.2.2 厌氧微生物的稀释液 应使用具有抗氧化作用的培养基作为稀释液。制备样品悬液时应尽量防止氧气进入，使用袋式拍击式均质器。 配备一些特殊的样品防护措施，如厌氧工作站等。3.3.2.3 嗜渗菌和嗜盐菌的稀释液 20%的无菌蔗糖溶液适用于嗜渗菌计数；研究嗜盐菌时，可使用15%无菌的氯化钠溶液作为稀释液。3.3.3 不同类型样品的取、制样 常用取样工具包括：均质器及均质杯、拍击器及拍击袋、试管、刻度吸管、微量移液器、玻璃珠、检测天平、水浴锅、玻璃棒、酒精灯

29、、镊子、刀子、电锯、托盘等。3.3.3.1 液体样品 制备液体样品稀释液时。用无菌移液管取10mL完全混匀的样品到带盖的无菌玻璃瓶中。加稀释液至100mL配成体积比为1：10的稀释液。也可选择质量体积比，取10g完全混匀的样品参加玻璃瓶，用无菌稀释液配制成100mL，制成质量体积比为1：10的稀释液。实际操作中，等效于1：10的质量比。按常规方法做进一步的稀释，整个样品稀释过程在30min内完成。3.3.3.2 小颗粒固体样品 面粉和奶粉等小颗粒固体样品的初识稀释液较容易配制。无菌称取10g样品参加到容积为100mL的无菌带盖玻璃瓶中，参加无菌稀释液至100mL刻度，配成质量体积比为1：10的

30、稀释液。以30cm的幅度摇动25次。必要时按常规方法进一步稀释。对高溶解度样品计数时必须小心，计数结果取决于样品在稀释液中的均匀性，而均匀性又与样品的初识状态有关常表述为个/g。要得到准确的检测结果，第一个稀释液的体积是否准确到达100mL非常重要。除体积因素外，pH和水活度的变化也必须加以考虑。另外，稀释液中样品的转接应在30min内完成。3.3.3.3 粉末状样品 检测表层下面样品中的细菌时，应至少取10g样品参加适量的无菌稀释液，并在适当的设备中均质。常用的均质方法是使用拍击式均质器。 将样品和稀释液一起放入无菌、耐用、薄而软的聚乙烯袋中，不接触均质器。均质时不会引起样品温度升高，较好地保护了待测样品。即使是冷冻样品，均质效果也很好。这种方法可用于制备浓度很低的稀释液。 3.3.3.4 外表样品 外表样品取样后，先放到一定体积如10mL的稀释液中，妥善保存，使样品保持原始状态。检测时，用适当的稀释剂进行定量稀释根据预测的污染程度稀释到所需稀释度。检测后根据稀释的倍数进行换算。