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1、大肠杆菌感受态细胞的制备什么是感受态？宿主大肠杆菌（E. coli DH-5） （R-，M-，Amp-）感受态细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态2012-4-16课件作者:蒋华云2015年3月2课件作者:蒋华云实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞制备的方通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞制备的方法和技术。法和技术。为接下来的为接下来的DNA重组与转化实验提供感受态细胞。重组与转化实验提供感受态细胞。2015年3月3课件作者:蒋华云实验原理处于对数生长期的细菌经低温处于对数生长期的细菌经低温CaCl2处理后接受外处理后接受外源源DNA的能力显著增加。的能力显著增加。细菌处于容易吸收外
2、源细菌处于容易吸收外源 DNA的状态叫感受态。的状态叫感受态。2015年3月4课件作者:蒋华云实验原理在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的一般缺乏此种转移所必需的mob 基因，因此不能基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源以摄取外源DNA。
3、2015年3月5课件作者:蒋华云实验原理转化转化(Transformation)是将外源是将外源DNA 分子引入受分子引入受体细胞体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。转化使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体体(R-,M-)，它可以容忍外源，它可以容忍外源DNA 分子进入体内分子进入体内并稳定地遗传给后代。它是微生物遗传、分子遗并稳定地遗传给后代。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。传、基因工程等研究
4、领域的基本实验技术。2015年3月6课件作者:蒋华云实验原理进入受体细胞的进入受体细胞的DNA 分子通过复制、表达实现遗分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子筛选出转化子(Transformant，即带有异源，即带有异源DNA 分子的受体细胞分子的受体细胞)。2015年3月7课件作者:蒋华云实验原理目前常用的感受态细胞制备方法目前常用的感受态细胞制备方法CaCl2法法 CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实法简便易
5、行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积总体积15%的无菌甘油于的无菌甘油于-70保存保存(半年半年),因此因此CaCl2 法使用广泛。法使用广泛。RbCl(KCl)法法2015年3月8课件作者:蒋华云仪器、材料与试剂 【仪器仪器】超净工作台超净工作台冷冻离心机冷冻离心机恒温摇床恒温摇床70冰箱冰箱1mL、200L移液枪（配套移液枪（配套枪头）枪头）10mL移液管移液管吸耳球吸耳球100mL 离心管离心管1.5mL小指管小指管【材料与试剂材料与试剂】大肠杆菌大肠杆菌DH5（R-，M-，Amp-） L
6、B液体培养基液体培养基0.1mol/L CaCl2溶液溶液30%甘油甘油2015年3月9课件作者:蒋华云实验步骤（一）受体菌的培养（一）受体菌的培养1.从从LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落，接种单菌落，接种于于35mL LB液体培养基中，液体培养基中，37下振荡培养过夜下振荡培养过夜（12h左右）。左右）。2.将该菌种悬液以将该菌种悬液以1:100的比例接种，取的比例接种，取500L菌液转菌液转接到接到50mL LB液体培养基中，液体培养基中，37振荡培养振荡培养23h至至OD600 0.5左右。左右。2015年3月10课件作者:蒋华云实验步骤（二）感受态细
7、胞的制备（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。）（注意：以下操作在超净工作台完成。） 1.将菌液转入将菌液转入100mL离心管中，冰上放置离心管中，冰上放置10min。2.在在4下，下，4000r/min离心离心10min。弃去上清，将管倒。弃去上清，将管倒置置1min以便培养液流尽。以便培养液流尽。3.用冰上预冷的用冰上预冷的0.1mol/L的的CaCl2 溶液溶液10mL轻轻悬浮轻轻悬浮细胞，冰上放置细胞，冰上放置30min。4.04 4000r/min离心离心10min，弃去上清，加入，弃去上清，加入2mL预冷的预冷的0.1mol/L的的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，
8、冰上溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。放置（务必冰上放置）。（注意：（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）2015年3月11课件作者:蒋华云实验步骤（三）感受态细胞的分装与冻存（三）感受态细胞的分装与冻存1.在在2mL制备好的感受态细胞中加入制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘甘油（即油（即1:1体积，甘油终浓度体积，甘油终浓度15%）,轻轻混匀。轻轻混匀。2.将此感受态细胞分装成每份将此感受态细胞分装成每份200L (1.5mL小指小指管管)，液氮速冻液氮速冻，快速转入，快速转入-70冰箱保存。冰箱保存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入转入-70冰箱保存。）冰箱保存。）2015年3月12课件作者:蒋华云实验分组全班分为2大组，每大组培养50mL菌液，最后每人制备得到1支200L的感受态细胞，全班至少保存32支感受态细胞。另外，没有到超净工作台操作的学生可以在实验室进行小量感受态的模拟制备。（非无菌条件下，制备完成后不保存。）2015年3月13课件作者:蒋华云思考题怎样制备大肠杆菌感受态细胞？如何获得适合用于制备感受态的菌体细胞？2015年3月14课件作者:蒋华云结束2012-4-16课件作者:蒋华云2015年3月15课件作者:蒋华云
