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1、mRNAmRNA差异显示技术（差异显示技术（DDDD）及其）及其对动物育种的作用对动物育种的作用 曲亮曲亮 黄瑞华黄瑞华* 邱新深邱新深 刘红林刘红林 王林云王林云(南京农业大学动物科技学院，南京，南京农业大学动物科技学院，南京，210095) 基金项目：江苏省高技术研究项目：江苏省高技术研究项目（BG2005304）DDDD的发明及其基础的发明及其基础v由由Liang于于1992年创立年创立是分离差异表达基因强有力的工具是分离差异表达基因强有力的工具在随后几年里，在随后几年里， Liang等在技术方面做了大量改等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便进，使技术更适用、更简便v基于基于R
2、T-PCR理论，依赖于理论，依赖于3种技术种技术1）RT-PCR技术技术2）以特定引物进行的）以特定引物进行的PCR技术技术3）DNA电泳技术电泳技术 DDDD的原理的原理5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 Poly(A) RNA5 T12MN 3锚定引物锚定引物逆转录逆转录5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5变性变性5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5退火退火5 T12MN 3锚定引物锚定引物寡核苷酸随机引物寡核苷酸随机引物3M N TTTTTTTTTTTT 5延长延长dNTP、Taq聚合酶
3、聚合酶3M N TTTTTTTTTTTT 55MNAAAAAAAAAAA 3变性、退火、延伸变性、退火、延伸电泳电泳显示显示T12MN(M为为A、G、C，N为为A、T、G、C) 启动启动cDNA第一链合成第一链合成不同长度的不同长度的PCR产物产物回收差异条带，再扩增，回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对克隆测序，同源比对随机结合到随机结合到cDNA链上链上DDDD目前的应用领域目前的应用领域v主要用于医学研究的癌症、神经、主要用于医学研究的癌症、神经、骨科、病理、生殖等领域骨科、病理、生殖等领域v动植物遗传、育种，动物营养及微动植物遗传、育种，动物营养及微生物等领域生物等领域DDDD的优
4、点的优点v以以RT-PCR和和DNA凝胶电泳为基础凝胶电泳为基础v灵敏度高，仅需灵敏度高，仅需0.2g的总的总RNAv可以同时比较多个样品间基因表达的差可以同时比较多个样品间基因表达的差异异 v可以同时检测到可以同时检测到“上调上调”及及“下调下调”的的基因基因 v时间短，实验过程中可步步验证比较时间短，实验过程中可步步验证比较 v可进行多基因家族的表达分析可进行多基因家族的表达分析 DDDD的缺点的缺点v假阳性高假阳性高 样品样品mRNA可能有部分降解可能有部分降解 有少量的有少量的DNA污染污染 单条带可能由一种以上单条带可能由一种以上cDNA 片段所构成片段所构成 有些特异有些特异cDN
5、A片段太短片段太短,在在Northern杂交时检测不到杂交信号杂交时检测不到杂交信号 PCR扩增了一些稀有扩增了一些稀有mRNA片段片段,在杂交时显示不出差异表达的信号在杂交时显示不出差异表达的信号 v绝大多数差异条带仅含有绝大多数差异条带仅含有3-UTR 500bp以内的一短片段的以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因 v对低丰度对低丰度mRNA检出率低检出率低DDDD技术改进技术改进v针对以上不足针对以上不足, ,特别是假阳性率高特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面做了大量的缺点，从以下几个方面做了大量改进：改
6、进：引物设计引物设计反应条件的优化反应条件的优化显示方法显示方法假阳性鉴定假阳性鉴定DDDD在动物育种中的应用在动物育种中的应用v比较不同品种间的差异v寻找数量性状QTL侯选基因v研究杂种优势机制 v比较世代间的差异 DD在现代动物育种中的应用展望在现代动物育种中的应用展望v目前主要致力于两个品种或组合间比较目前主要致力于两个品种或组合间比较v我们在苏淮白猪选育中的应用思路：我们在苏淮白猪选育中的应用思路：提高各世代猪群生产性能的遗传稳定性，建立提高各世代猪群生产性能的遗传稳定性，建立和完善繁殖性能和肉质性状的和完善繁殖性能和肉质性状的DD技术技术分析新品系内不同优点的家系或类型间的遗传分析新
7、品系内不同优点的家系或类型间的遗传相关相关 检测新品系猪与其它品种猪的遗传距离检测新品系猪与其它品种猪的遗传距离引物设计引物设计vmol等将等将12种锚定引物变为种锚定引物变为4种，并发现种，并发现G的扩增效的扩增效果最好果最好v王夏等在王夏等在T12MN之前加上了一段之前加上了一段T7启动子序列，提启动子序列，提高了高了PCR反应的严谨性反应的严谨性vLiang发现发现910个个mer长度的随机引物比较适宜长度的随机引物比较适宜vLiang还发现，当长度为还发现，当长度为13bp，在，在5端增加端增加Hind酶切位点，能更有效的扩增，并能提高特异性酶切位点，能更有效的扩增，并能提高特异性反应
8、条件优化反应条件优化vRNA模板量在模板量在2-3g时，能扩增出较多的条带时，能扩增出较多的条带v不同条件下不同条件下dNTP浓度不是固定不变的浓度不是固定不变的 v1.5-2.0mmol/L的的Mg2+浓度效果较好浓度效果较好v40-42的退火温度通常能得到较好的扩增效的退火温度通常能得到较好的扩增效果，周宁新等在果，周宁新等在PCR的头两个循环，用低严的头两个循环，用低严谨的退火温度谨的退火温度36，在随后的循环中退火温，在随后的循环中退火温度提高到度提高到45，获得了很清晰的电泳图谱，获得了很清晰的电泳图谱显示方法显示方法v最初最初DDRT-PCR通过放射性同位素通过放射性同位素在变性胶
9、上进行放射自显影成像在变性胶上进行放射自显影成像Sanguinetti介绍了一个快速银染方法，只介绍了一个快速银染方法，只需需15分钟，而且容易克隆回收分钟，而且容易克隆回收 Rompf等通过琼脂糖凝胶电泳分辨差异等通过琼脂糖凝胶电泳分辨差异cDNA片段片段余桂华等建立了荧光余桂华等建立了荧光mRNA差异显示方法，差异显示方法，最大限度地降低了假阳性最大限度地降低了假阳性假阳性的鉴定假阳性的鉴定vNorthern blot仍是鉴定差异的一个主要手段；分析仍是鉴定差异的一个主要手段；分析较多条带，反向较多条带，反向Northern blot是较为切合实际的选是较为切合实际的选择择vHeinz通过
10、通过SSCP分析排除了非差异表达的分析排除了非差异表达的cDNA污污染染vCallard把纯化后的把纯化后的PCR 产物分成两部分产物分成两部分:一部分用一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆vSompayra设计了向设计了向5步移的方法步移的方法比较不同品种间的差异比较不同品种间的差异vPan等应用等应用DD寻找杜洛克和二花脸寻找杜洛克和二花脸猪背最长肌中差异表达的猪背最长肌中差异表达的mRNA，对对10条差异表达条差异表达cDNA克隆、测序，克隆、测序，有有6条条cDNA显示与显示与GenBank上已鉴上已鉴定的基因类似，另外定的基因类似，另外
11、4条是未知基因条是未知基因寻找数量性状寻找数量性状QTLQTL侯选基因侯选基因vJanzen等用等用DD分离的差异表达分离的差异表达cDNA 片段与猪片段与猪ARPP-16转转录物的录物的3末端一致，试验组猪末端一致，试验组猪ARPP-16的表达量比对照组高的表达量比对照组高4倍倍,提示猪提示猪ARPP-16基因可能在猪肌肉生长中起重要作用基因可能在猪肌肉生长中起重要作用vS.Ponsuksili应用应用DD方法寻找猪眼肌面积的可能侯选方法寻找猪眼肌面积的可能侯选ESTs，构建，构建4个个RNA池，显示了池，显示了27条非共有条带，有条非共有条带，有2个克隆显示个克隆显示与已知基因有高同源性，
12、与已知基因有高同源性，2个克隆与个克隆与EST序列相似序列相似vM.D.Li等应用等应用DD方法发现梅山猪的方法发现梅山猪的TSH-基因过量表达，大基因过量表达，大约为成年约为成年WC猪的猪的3倍，推测倍，推测亚基的过量表达很可能是梅山亚基的过量表达很可能是梅山猪比白猪合成系性成熟早的原因猪比白猪合成系性成熟早的原因 研究杂种优势机制研究杂种优势机制vY G Liu应用应用DD技术研究两个杂交组合背最长肌中基因表达技术研究两个杂交组合背最长肌中基因表达的差异，观测到的差异，观测到8个不同的典型表达模式，相关性分析表明，个不同的典型表达模式，相关性分析表明，大白、梅山正反杂交组合与母体效应有关，
13、而在大白、长白大白、梅山正反杂交组合与母体效应有关，而在大白、长白杂交组合中，父本效应在杂种的基因表达中起作用，或基因杂交组合中，父本效应在杂种的基因表达中起作用，或基因表达偏向于某一亲本表达偏向于某一亲本vLiu(2005)等在研究大白和长白杂交组合背最长肌中基因表等在研究大白和长白杂交组合背最长肌中基因表达的差异时，发现了一个猪的新基因，命名为猪的达的差异时，发现了一个猪的新基因，命名为猪的CA-基基因，他催化可逆的二氧化碳水合作用，但还不确定与杂种优因，他催化可逆的二氧化碳水合作用，但还不确定与杂种优势是否相关势是否相关 比较世代间的差异比较世代间的差异vRen等研究了梅山猪和大白猪及其正反等研究了梅山猪和大白猪及其正反F1代代杂种猪背部皮下脂肪组织间的基因表达情况，杂种猪背部皮下脂肪组织间的基因表达情况，4 条条 EST 分别与分别与 GenBank 序列同源性较高，序列同源性较高，其余其余36条条EST在亲子代之间的差异表达方式在亲子代之间的差异表达方式不尽相同不尽相同
