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1、实验二实验二 革兰氏染色及真菌形革兰氏染色及真菌形态结构观察态结构观察 一、实验目的一、实验目的学习细菌的革兰氏染色原理和方法了解霉菌、酵母菌的特点并观察其形态特征了解霉菌、酵母菌的特点并观察其形态特征二、实验原理二、实验原理单染色法：单染色法：只能观察微生物的大小、形状、只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。它的特殊构造等。复染色法：复染色法：用两种或两种以上染色液进行用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：鉴别染色法。常用的有：革兰氏
2、染色法革兰氏染色法、荚膜染色法、芽孢染色法、荚膜染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。鞭毛染色法等。(一一) 革兰氏染色革兰氏染色丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究细菌细胞壁的结构G肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。G细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。(二二) 了解霉菌、酵母菌的特点了解霉菌、酵母菌的特点 并观察其形态特征并观察其形态特征三、实验材料三、实验材料大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（24h培养物）革兰氏染色液一套真核微生物标
3、片四、实验步骤四、实验步骤革兰氏（革兰氏（Gram）染色法染色法1. 涂片涂片2. 初染：初染：在做好的涂面上滴加草酸在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染铵结晶紫染液，染1分钟，倾去分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。染液，流水冲洗至无紫色。3. 媒染：媒染：先用新配的路哥氏碘液冲先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面去残水，而后用其覆盖涂面1分分钟，后水洗。钟，后水洗。4. 脱色：脱色：除去残水后，滴加除去残水后，滴加95%酒酒精进行脱色约精进行脱色约1520秒，后立即秒，后立即用流水冲洗。用流水冲洗。5. 复染：复染：滴加番红染色液，染滴加番红染色液，染35分钟，水洗后用吸水纸吸干
4、。分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：镜检：观察染色结果并绘图。观察染色结果并绘图。注意事项注意事项1.1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。严格规定。2.2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸
5、去玻片上的残水，以免染色液被稀释应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。而影响染色效果。3.3.选用幼龄的细菌。选用幼龄的细菌。G+G+菌培养菌培养12h-16h12h-16h，E.coliE.coli培养培养24h24h。若菌龄太老，由于菌体死若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。观察酵母菌形态和无性繁殖：用高倍镜观察啤酒酵母的用高倍镜观察啤酒酵母的形态和出芽繁殖。形态和出芽繁殖。观察黑根霉菌丝情况和子囊孢子情况（着重辨认孢子囊、包囊梗、假根）：观察青霉菌丝和分观察青霉菌丝和分生孢子着生情况：生孢子着生情况：1.单轮生青霉群；单轮生青霉群；2.对称二轮对称二轮生青霉群；生青霉群；3.多轮生青霉群；多轮生青霉群；4.不对称生青霉群不对称生青霉群 观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着生情况（着重辨认分生孢子梗、足细胞和分生孢子）：五、实验结果记录所观察到的二种菌革兰氏染色结果的差别，并判断是阳性还是阴性观看根霉菌、青霉菌、曲霉菌与酵母菌根霉菌、青霉菌、曲霉菌与酵母菌的示范片绘图、写实验报告六、问题与讨论要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？哪一步是关键？Why?本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净！下周再见！
