第二章细菌感染实验诊断

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1、第二章细菌感染实验诊断第二章细菌感染实验诊断 疾病的种疾病的种类不断不断发生生变迁，迁，传染病如染病如鼠疫等已明鼠疫等已明显减少，相反，由条件致病菌减少，相反，由条件致病菌引起的内源性感染却明引起的内源性感染却明显增多。同增多。同时，新，新的病原菌不断出的病原菌不断出现，原有的病原菌因，原有的病原菌因变异、异、耐耐药等又重新流行。等又重新流行。 目前，目前，临床遇到主要是条件致病菌，床遇到主要是条件致病菌，引起的感染。正常菌群与病原菌的致病引起的感染。正常菌群与病原菌的致病性是相性是相对的，因此，既不要的，因此，既不要轻易易认为分分离出的非致病菌是离出的非致病菌是污染菌，也不要染菌，也不要轻易

2、易认为所所发现的的细菌就是菌就是该感染的病原菌，感染的病原菌，必必须结合合临床床进行行进一步的一步的诊断。断。 第一节 临床感染性疾病 实验诊断要求 一、一、诊断的目的断的目的 1.1.以疾病的病原学以疾病的病原学诊断断为目的目的, ,只需只需鉴 定到定到细菌的种。菌的种。 2.2.为提供治提供治疗方案方案为目的，要目的，要进行行临 床床标本的直接本的直接药物敏感物敏感试验。 3.3.以流行病学研究以流行病学研究为目的目的, ,要要鉴定到型。定到型。4.4.以了解以了解细菌与感染的关系菌与感染的关系为目的目的, ,应 该做做细致的致的鉴定。定。 二、诊断试验的选择1.1.选择有有鉴定价定价值的

3、的试验。2.2.选择简易、快速、方便的易、快速、方便的试验，达，达 到目的即可。到目的即可。3.3.综合考合考虑试验的敏感性和特异性。的敏感性和特异性。 敏感性敏感性= =阳性阳性结果数果数/ /感染病人数，感染病人数，越高假阴性就越少。越高假阴性就越少。 特异性特异性= =阴性阴性结果数果数/ /未感染病人数，未感染病人数，越高假阳性就越少。越高假阳性就越少。三、常用诊断流程 1. 1.双歧索引双歧索引用于相互区用于相互区别比比较容容易易, ,有特征的有特征的细菌，菌，如革如革兰阴性杆菌初步阴性杆菌初步分群；分群；对于相互区于相互区别较难的的细菌，菌，鉴定定项目目较多多, ,用起来不太用起来

4、不太方便。方便。2.2.表解法：表解法：将各种将各种细菌及其多种特性列成矩菌及其多种特性列成矩阵表表格，使相互的区格，使相互的区别点十分明点十分明显，便于，便于分析比分析比较。此法。此法对于相互区于相互区别比比较复复杂的的细菌，如菌，如肠杆菌科的初步分属。杆菌科的初步分属。3.3.数字数字编码鉴定法定法 将所得生化反将所得生化反应模式模式转化成数学化成数学模式，可把模式，可把细菌生化反菌生化反应结果果转化化成数字，成数字，经检索手册又可将索手册又可将转化成化成细菌名称。与菌名称。与电脑分析分析软件配套，件配套，形成了半自形成了半自动或全自或全自动细菌分析系菌分析系统。组别试验项目代码结果结果代

5、码总值 1硫化氢苯丙氨酸葡萄酸盐 4 2 1 - - + 0 0 11 2靛基质甲基红枸橼酸盐 4 2 1 - + + 0 2 13 3尿素动力产气 4 2 1+ 4 2 1 7 4赖氨酸鸟氨酸棉子糖 4 2 1+- 4 2 0 6 5山梨醇侧金花醇木胶糖 4 2 1+- 4 2 0 6第二节 临床标本的采集 与处理 一、标本采集的一般原则 1.1.病程早期、急性期或症状典型病程早期、急性期或症状典型时， 使用抗生素前。使用抗生素前。 2. 2.无菌采集无菌采集 应无无污染，染，严格格进行无行无 菌操作。菌操作。3.3.根据目的菌的特性用不同的方法采集根据目的菌的特性用不同的方法采集 适量适量

6、标本，采集量不本，采集量不应过少。少。4.4.注意在不同病程采集不同部位注意在不同病程采集不同部位标本。本。5.5.采集采集标本本时要防止要防止传播和自身感染。播和自身感染。二、标本的处理1.1.标本保存在本保存在44环境中，在境中，在2h2h之内送之内送检。 脑脊液脊液则要在要在25 25 保存，用于保存，用于细菌培菌培 养的养的标本保存本保存时间不不应超超过24h24h。对环 境敏感的境敏感的细菌菌应保温并立即送保温并立即送检。2.2.标本中可能含有致病菌，必本中可能含有致病菌，必须注意安全注意安全 防防护。切勿。切勿污染染环境。境。对于烈性于烈性传染病染病 标本运送本运送时更要由更要由专

7、人运送，人运送，严格按格按规 定包装。定包装。3.3.厌氧性氧性标本本应放在放在专门的运送瓶或的运送瓶或试管管 内运送，有内运送，有时可直接用抽取可直接用抽取标本的注射本的注射 器运送。器运送。 第三节 细菌形态学检查 一、显 微 镜 1.1.普通光学普通光学显微微镜用油用油镜放大放大10001000倍，一般倍，一般细菌菌 均能清均能清 楚看到。楚看到。 2. 2.暗暗视野野显微微镜用于用于检查不染色的活不染色的活细菌和螺旋菌和螺旋 体的形体的形态及运及运动观察。察。 3. 3.相差相差显微微镜主要用于主要用于检查不染色活不染色活细菌的形菌的形态 及某些内部及某些内部结构。构。4.4.荧光光显

8、微微镜可看到可看到发射射荧光的光的细菌。菌。还应用用 于免疫于免疫荧光技光技术中。中。 5.5.电子子显微微镜有透射有透射电子子显微微镜和和扫描描电子子显 微微镜。前者适于。前者适于观察察细菌内部超微菌内部超微结构，后构，后 者适于者适于对细菌表面菌表面结构及附件构及附件观察。察。 二、不染色细菌标本检查 1.1.主要用于主要用于检查生活状生活状态下下细菌的菌的动力及运力及运动状况。可状况。可对某些病原某些病原菌作出初步菌作出初步鉴定，如霍乱菌。定，如霍乱菌。2.2.螺旋体由于不易着色并有形螺旋体由于不易着色并有形态特特征，故多用不染色征，故多用不染色标本作暗本作暗视野野显微微镜检查。 三、细

9、菌染色标本的检查 细菌菌标本本经染色后，除能清楚看染色后，除能清楚看到到细菌的形菌的形态、大小、排列方式外，、大小、排列方式外，还可根据染色反可根据染色反应将将细菌菌进行分行分类。(一)常用染料 分分为碱性和酸性两大碱性和酸性两大类。此外，。此外，还有复有复合染料。合染料。 1 1碱性染料碱性染料 电离后离后显色离子色离子带正正电荷，荷， 易与易与带负电荷的被染物荷的被染物结合。由于合。由于细菌菌 均均带负电荷，易与染料荷，易与染料结合而着色。常合而着色。常 用的有碱性复用的有碱性复红、结晶紫、美晶紫、美蓝等。等。 2 2酸性染料酸性染料 电离后离后显色离子色离子带负电荷，荷，易与易与带正正电

10、荷的被染物荷的被染物结合。合。细菌都菌都带有有负电荷故不易着色。通常用来染荷故不易着色。通常用来染细胞胞浆，而很少用于而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料菌的染色。常用的酸性染料有伊有伊红、刚果果红等。等。3 3复合染料复合染料( (中性染料中性染料) )及及荧光染料光染料 复合染料是碱性染料和酸性染料的复合染料是碱性染料和酸性染料的 复合物，如瑞氏染料复合物，如瑞氏染料( (伊伊红美美蓝) )、 姬姆姆萨染料染料( (伊伊红天青天青) )等；等；荧光染光染 料如料如荧光光标记的抗体，的抗体，荧光素常用光素常用 异硫异硫氢基基荧光素。光素。这些染色常用于些染色常用于 某些特殊的染色技某些特殊的

11、染色技术中。中。（二）常用的染色方法在在细菌感染菌感染标本的本的检查中，中，临床上常床上常用的染色方法有革用的染色方法有革兰染色、抗酸染色染色、抗酸染色和和荧光染色。光染色。 1革兰染色最最经典、最常用的染色方法。在分离典、最常用的染色方法。在分离培养前都要培养前都要进行革行革兰染色、染色、镜检。通。通过革革兰染色将所有染色将所有细菌分菌分为G G+ +菌和菌和G G- -菌两大菌两大类，可初步，可初步识别细菌，有助于菌，有助于进一步一步鉴定。定。 结合合细菌特殊菌特殊结构及排列方式，构及排列方式，对病病原菌可原菌可进行行鉴定，其定，其结果果为临床早期床早期诊断断及治及治疗提供了依据。提供了依

12、据。 革革兰染色可染色可为临床床选择用用药提供参考，提供参考，帮助帮助临床制床制订有有针对性的治性的治疗方案。因方案。因为G G+ +菌和菌和G G- -菌菌对抗生素敏感性不同，且致病抗生素敏感性不同，且致病物物质 及其作用机理也不同。及其作用机理也不同。2抗酸染色 将将细菌分菌分为抗酸性和非抗酸性抗酸性和非抗酸性细菌两菌两大大类。因。因为大多数病原菌大多数病原菌为非抗酸性，所非抗酸性，所以抗酸染色不作以抗酸染色不作为常常规检查项目。目。 只用于只用于结核病等核病等检查。抗酸染色的。抗酸染色的鉴定定结果。果。对疾病的疾病的诊断和治断和治疗具有重要参具有重要参考价考价值。3荧光染色 敏感性敏感性

13、强，效率高而且容易，效率高而且容易观察察结果，在果，在临床床细菌菌鉴定中有很大的定中有很大的实用价用价值。主要用于。主要用于结核分枝杆菌、麻核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志及痢疾志贺菌等的菌等的检测。 此外此外还有：有：鞭毛染色可鞭毛染色可观察有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，察有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在在细菌菌鉴定中很重要。定中很重要。异染异染颗粒染色粒染色镜检异染异染颗粒，粒，为临床早期床早期诊断断白喉提供依据。白喉提供依据。第四节细菌分离培养与接种技术 绝大多数大多数细菌在适宜的条件下可以生菌在适宜的条件下可以生长，细菌感染性患者菌感染性患者标本只有本只

14、有经过细菌的分菌的分离培养、离培养、鉴定和定和药物敏感物敏感试验，才可，才可对感染性疾病感染性疾病进行病原学行病原学诊断并指断并指导临床床用用药。因此，。因此，细菌培养菌培养对疾病的疾病的诊断、断、预防和治防和治疗具有重要的作用。具有重要的作用。（一）细菌室的符合条件1 1细菌室必菌室必须安装安装严密的密的门窗，以防室窗，以防室 内内环境受到外界的境受到外界的污染。且室内禁用染。且室内禁用 风扇，避免扇，避免细菌的播散。菌的播散。2 2细菌室必菌室必须安装供空气消毒的紫外安装供空气消毒的紫外线 灯，置于操作台上面灯，置于操作台上面lmlm处，每天开始，每天开始 工作前照射工作前照射 20min

15、 20min。对其消毒效果要其消毒效果要 定期定期检查，及，及时更更换失效的灯管。失效的灯管。3 3室内室内应备有消毒有消毒剂，用于，用于试验中中发生生 菌液洒菌液洒溅时的及的及时消毒消毒处理。同理。同时还 应备有供工作人有供工作人员浸手用的盛有消毒浸手用的盛有消毒 剂的水盆、肥皂及自来水源等。的水盆、肥皂及自来水源等。4 4室内操作台室内操作台须每日用消毒每日用消毒剂擦洗，地擦洗，地 面至少一周用消毒面至少一周用消毒剂擦洗擦洗1 1次。次。5 5对接收的接收的标本、无菌器具、用本、无菌器具、用过的物的物 品等品等应明明显分开井放在指定位置。同分开井放在指定位置。同 时要要对用用过的物品及的物

16、品及时进行行灭菌菌处理。理。6 6细菌室菌室应有当地的气温特点的消防有当地的气温特点的消防设 备。(二)无菌实验室1 1无菌室无菌室应完全封完全封闭，人，人员出入出入应 有两道有两道门，其，其间应隔有隔有 缓冲区。冲区。2 2用前用前应以紫外以紫外线消毒消毒30min30min，定期，定期 用乳酸或甲用乳酸或甲醛熏蒸，熏蒸，彻底消毒。底消毒。3 3在无菌室中一般在无菌室中一般仅限于分装无菌的限于分装无菌的 培养基及培养基及传染性染性强的的细菌的接种，菌的接种， 不不进行有菌行有菌标本的分离及其他操作。本的分离及其他操作。4 4无菌室内无菌室内应仅限操作人限操作人员进人，而且人，而且 进入无菌室

17、入无菌室应着隔离衣和着隔离衣和专用鞋，操用鞋，操 作作时戴口罩，随戴口罩，随时保保证室内的无菌状室内的无菌状 态。5 5条件有限的条件有限的实验室，可用超室，可用超净工作台工作台 代替无菌代替无菌实验室室进行相行相应的操作。超的操作。超 净工作台工作台应选择垂直气流通垂直气流通风方式。方式。6 6无菌室无菌室应配配备空空调设备，保，保证不因室不因室 温而影响工作。温而影响工作。(三)基本设备和器具 用于用于细菌培养的温箱、菌培养的温箱、C02C02培养箱、培养箱、厌氧氧培养培养设备； 用于用于观察察细菌形菌形态及及标本直接本直接镜检的的显微微镜； 用于物品用于物品灭菌的高菌的高压蒸气蒸气灭菌器

18、、干烤菌器、干烤箱；箱； 用于用于储存培养基、存培养基、诊断用血清、抗生素断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；及菌种等的冰箱和冷藏柜； 用于挑取用于挑取标本、接种等的接种器具，包本、接种等的接种器具，包括接种括接种环和接种和接种针；制；制备培养基培养基时用的用的pHpH计； 用于接种器具用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。皿，以及离心机、天平等。二、培 养 基由人工方法配制而成的，由人工方法配制而成的，专供微生物生供微生物生长繁殖繁殖使用的混合使用的混合营养物制品。养物制品。适

19、宜的培养基不适宜的培养基不仅可用于可用于细菌的分离菌的分离纯化培养、化培养、传代、菌种保存，代、菌种保存，还可用于研究可用于研究细菌的生理、菌的生理、生化特性，是生化特性，是对病原菌分离病原菌分离鉴定的重要定的重要环节和和必不可少的手段。必不可少的手段。 (一)培养基的组成成分1.1.营养物养物质: (1): (1)蛋白蛋白胨；(2)(2)肉浸液；肉浸液；(3)(3)牛肉牛肉膏；膏；(4)(4)糖糖类；(5)(5)血液；血液；(6)(6)无机无机盐类； (7) (7)鸡蛋和蛋和动物血清；物血清；(8)(8)生生长因子：提供因子：提供细菌生菌生长繁殖所需要的氮源和碳源，繁殖所需要的氮源和碳源，还

20、有生有生长因子。因子。2.2.凝固物凝固物质 制制备固体培养基固体培养基时，加入，加入琼脂，脂，琼脂是半乳糖胶，脂是半乳糖胶，9898以上以上时可溶于水，在可溶于水，在45 45 以下以下则凝固成凝胶状凝固成凝胶状态。3.3.抑制抑制剂和指示和指示剂 用于用于选择、鉴定及判断定及判断结果。果。(二)培养基种类1 1基基础培养基培养基 含有生含有生长所需的基本所需的基本营 养成分，称肉养成分，称肉汤，用于增菌、，用于增菌、检验， 是制是制备其他培养基的基其他培养基的基础成分。成分。2 2营养培养基养培养基 在基在基础培养基中可加入培养基中可加入 葡萄糖、血液、生葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，

21、因子等特殊成分， 供供营养要求养要求较高的高的细菌和菌和须要特殊生要特殊生 长因子的因子的细菌生菌生长。最常用的是血平。最常用的是血平 板等。板等。3 3鉴别培养基培养基 利用利用细菌分解能力及代菌分解能力及代 谢产物的不同，在培养基中加入特定物的不同，在培养基中加入特定 的作用底物和指示的作用底物和指示剂，观察察细菌生菌生长 过程中分解底物所程中分解底物所释放的不同放的不同产物，物， 通通过指示指示剂的反的反应不同来不同来鉴别细菌。菌。 如糖如糖发酵培养基。酵培养基。4 4选择培养基培养基 在培养基中加入抑制在培养基中加入抑制剂而而 抑制抑制杂菌生菌生长，有助于，有助于对所所选择的的细菌菌

22、生生长。5 5特殊培养基包括特殊培养基包括厌氧培养基和氧培养基和细菌菌L L型型 培养基等。培养基等。(三)分离培养基的选择 依据依据卫生部生部临床床检验中心推荐，中心推荐，应备有有 如下分离培养基：如下分离培养基：1 1血平板血平板 适于各适于各类细菌的生菌的生长。2 2巧克力血平板巧克力血平板 其中含有其中含有V V和和X X因子，因子， 适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的 标本。本。3 3中国中国蓝平板或伊平板或伊红美美蓝平板平板 有有选择地地 促促进G G_ _菌生菌生长，是，是较好的弱好的弱选择性培养性培养 基。基。4 4麦康麦康凯平板平板 具中等具中等

23、强度度选择性，是非性，是非 发酵菌酵菌鉴定的依据。定的依据。5 5SSSS琼脂脂 有有较强的抑菌力，用于志的抑菌力，用于志贺菌菌 和沙和沙门菌的分离。菌的分离。6 6碱性碱性琼脂脂 用于从用于从粪便中分离霍乱弧菌便中分离霍乱弧菌 及其它弧菌。及其它弧菌。7 7血液增菌培养基血液增菌培养基 用于从血液、骨髓中用于从血液、骨髓中 分离常分离常见病原菌。病原菌。8 8营养肉养肉汤 用于用于标本及各本及各类细菌的增菌。菌的增菌。三、细菌接种与分离技术( (一一) )平板划平板划线分离法分离法 1 1连续划划线分离法分离法 此法主要用于此法主要用于 杂菌不多的菌不多的标本。本。 2 2分区划分区划线分离

24、法分离法 本法适用于本法适用于杂 菌量菌量较多的多的标本。本。获得得单个菌落。个菌落。( (二二) )斜面接种法斜面接种法 该法主要用于法主要用于单个菌落的个菌落的纯培养、培养、 保存菌种或保存菌种或观察察细菌的某些特性。菌的某些特性。 ( (三三) )液体接种法液体接种法 多用于一些液体生化多用于一些液体生化试验管的接种。管的接种。( (四四) )穿刺接种法在穿刺接种法在试管内壁与液面交接管内壁与液面交接处 的此法主要用于半固体培养基、明胶的此法主要用于半固体培养基、明胶 及双糖管的接种。及双糖管的接种。 ( (五五) )倾注平板法注平板法 测定牛乳、定牛乳、饮水和尿液等水和尿液等标本本细菌

25、数菌数 时常用此方法。常用此方法。( (六六) )涂布接种法涂布接种法 常用于常用于纸片法片法药物敏感性物敏感性测定，也可定，也可 用于被用于被检标本中的本中的细菌菌计数。数。四、细菌培养方法 ( (一一) )需氧培养法需氧培养法 最常用的培养方法，适于需氧和兼性最常用的培养方法，适于需氧和兼性厌氧菌的培养。氧菌的培养。( (二二) )二氧化碳培养法二氧化碳培养法 常以下列方法供常以下列方法供给 C02 C02。 1 1二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱 是一台特制的培养是一台特制的培养箱，既能箱，既能调节C02C02的含量，又能的含量，又能调节所需所需的温度。的温度。 此法适于大型此法适于大型实验

26、室室应用。用。 2 2烛缸法缸法 将已接种好的培养基置将已接种好的培养基置 干燥器内，并放人点燃的蜡干燥器内，并放人点燃的蜡烛。干燥。干燥器盖的器盖的边缘涂亡凡士林，盖上盖子，涂亡凡士林，盖上盖子，烛光光经几分几分钟后自行熄后自行熄灭，此，此时干燥器内干燥器内C02C02含量含量约占占5 5-10-10，然后将干燥器放入，然后将干燥器放入35 35 温箱内培养。温箱内培养。 3 3化学法化学法 按每升容按每升容积加入碳酸加入碳酸氢钠0 04g4g和和浓盐酸酸0 035ml35ml的比例，分的比例，分别置于容器内。将容置于容器内。将容器器连同接种好的培养基都放人干燥器内，同接种好的培养基都放人干

27、燥器内，盖盖紧干燥器的盖子，干燥器的盖子，倾斜容器使斜容器使浓盐酸与酸与碳酸碳酸氢钠接触生成接触生成CO2CO2。( (三三) )厌氧培养法氧培养法第五节细菌产物的检测及鉴定 一、细菌毒素的检测 ( (一一) )内毒素的内毒素的测定定 主要用于主要用于诊断病人是否断病人是否发生革生革兰阴性阴性细菌感染。另外，菌感染。另外，还可用于可用于检测注射用液注射用液和生物制品有无内毒素和生物制品有无内毒素污染。染。 1 1细菌内毒素的致菌内毒素的致热作用作用 常以家兔常以家兔作作为实验动物，家兔正常体温物，家兔正常体温38385 5 40 40 。抽取被。抽取被检物注入家兔耳物注入家兔耳静脉，静脉，记录

28、体温体温变化情况，分析化情况，分析实验结果。果。2 2鲎试验 鲎血液的有核血液的有核变形形细胞内含凝胞内含凝 固固酶原及凝固蛋白原，当内毒素与原及凝固蛋白原，当内毒素与鲎变形形细胞胞冻融后的溶解物融后的溶解物( (鲎试剂) )接触接触时，可激活凝固可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原，使可溶性的凝固蛋白原原变成凝胶状成凝胶状态的凝固蛋白，利用此种的凝固蛋白，利用此种反反应来来检测内毒素。内毒素。本本试验对内毒素具有高度特异性，灵敏内毒素具有高度特异性，灵敏度高，可度高，可检查出出0 0005005 0 00005g0005gmlml内毒素。且操作内毒素。且操作简便，速度快，在便，速度快，在2h

29、2h内即可得出内即可得出结论。( (二二) )外毒素的外毒素的测定定1 1体内毒力体内毒力试验 细菌外毒素菌外毒素对机体的毒性机体的毒性作用，可被相作用，可被相应抗毒素中和，若先抗毒素中和，若先给动物物注射抗毒素，然后再注射外毒素，注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物物不不产生中毒症状。生中毒症状。2 2体外毒力体外毒力试验 外毒素抗原性外毒素抗原性强，可刺激，可刺激机体机体产生相生相应的抗体。在体外以的抗体。在体外以细菌外毒菌外毒素的特异性免疫血清素的特异性免疫血清为抗体与被抗体与被检细菌外菌外毒素毒素( (抗原抗原) )进行抗原抗体反行抗原抗体反应，来，来检测外外毒素，从而毒素，从而鉴定定

30、细菌是否菌是否产生生该种毒素。种毒素。如白喉棒状杆菌的如白喉棒状杆菌的ElekElek平板毒力平板毒力测定。定。ELISAELISA法如葡萄球菌法如葡萄球菌肠毒素、毒素、肠产毒毒型大型大肠埃希菌埃希菌LTLT及及STST等的等的测定。定。 二、细菌生化反应鉴定 不同不同细菌具有各自独特的菌具有各自独特的酶系系统，因，因而而对底物的分解能力各异，其代底物的分解能力各异，其代谢的的产物也不相同。物也不相同。这些代些代谢产物又各具有不物又各具有不同的生物化学特性，同的生物化学特性，为此，可利用生物此，可利用生物化学的方法化学的方法测定定这些代些代谢产物以物以鉴定定细菌。菌。 (一)碳水化合物的代谢试

31、验 1 1糖糖( (醇、苷醇、苷) )类发酵酵试验(1)(1)原理：由于原理：由于细菌含有菌含有发酵不同糖酵不同糖类的的酶，故分解糖的能力不同，故分解糖的能力不同，终末末产物亦不一物亦不一致。有的能分解，有的致。有的能分解，有的仅能分解能分解1-21-2种，种，还有的不能分解。有的有的不能分解。有的产酸酸产气，有的气，有的仅产酸，故可利用酸，故可利用鉴别细菌。菌。(2)(2)培养基：在培养基中加入培养基：在培养基中加入0.50.5-1-1的的糖糖类( (单糖、双糖或多糖糖、双糖或多糖) )、醇、醇类( (甘露醇、甘露醇、肌醇等肌醇等) )、苷、苷类( (水水杨苷、菊糖等苷、菊糖等) )。可。可

32、为液体、半固体、固体或微量生化管几种液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。型。(3)(3)方法：将方法：将细菌接种到糖菌接种到糖发酵培养基中，酵培养基中，培养数培养数h h小小时至至2w2w后，后，观察察结果。果。 (4)(4)结果：能分解糖果：能分解糖产酸酸时，呈酸性反，呈酸性反应，若若产气可出气可出现气泡或培养基内有裂隙等气泡或培养基内有裂隙等现象象; ;若不分解，除有若不分解，除有细菌生菌生长外，无任外，无任何何变化。化。(5)(5)应用：是用：是鉴定定细菌最主要的菌最主要的试验，特，特别对肠杆菌科杆菌科细菌的菌的鉴定尤定尤为重要重要 。2氧化一发酵试验(OF试验)(1)(1)原理：原

33、理：细菌分解葡萄糖必菌分解葡萄糖必须有分子有分子氧参加的称氧参加的称为氧化型；氧化型；进行无氧降解行无氧降解的称的称为发酵型；不分解葡萄糖的酵型；不分解葡萄糖的细菌菌称称为产碱型。利用此碱型。利用此试验可区分可区分细菌菌的代的代谢类型。型。(2)(2)培养基培养基HLHL：Hugh-LeifsonHugh-Leifson二氏培养二氏培养基。基。(3)(3)方法：将待方法：将待检菌同菌同时穿刺接种两支穿刺接种两支HLHL培培养基，一支滴加无菌液体石蜡，高度不少养基，一支滴加无菌液体石蜡，高度不少于于1cm1cm。将培养基于。将培养基于35 35 培养培养48h48h或更或更长。 (4)(4)结果

34、：两支培养基均无果：两支培养基均无变化化为产碱型或碱型或小分解糖型；两支培养基均小分解糖型；两支培养基均产酸酸为发酵型；酵型；若不加石蜡的培养基若不加石蜡的培养基产酸酸为氧化型。氧化型。(5)(5)应用：主要用于用：主要用于肠杆菌科杆菌科细菌与非菌与非发酵酵菌的菌的鉴别型或型或产碱型。也呵用于葡萄球菌碱型。也呵用于葡萄球菌与微球菌与微球菌间的的鉴别。3-半乳糖苷酶试验(1)(1)原理：有的原理：有的细菌可菌可产生生 半乳糖苷半乳糖苷酶，能分解，能分解邻- -硝基酚硝基酚 -D- -D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)(ONPG)，而生成黄色的，而生成黄色的邻- -硝基酚，在很硝基酚，在很低低浓度下

35、也可度下也可检出。出。(2)(2)试剂：O O75M ONPG75M ONPG溶液：取溶液：取80mg80mg溶于溶于15ml15ml蒸蒸馏水中，在加入水中，在加入缓冲液冲液(6(69g NaH 9g NaH 2 2POPO4 4溶于溶于45ml45ml蒸蒸馏水中，用水中，用3030NaOHNaOH调控控pHpH为7.07.0，再加水至，再加水至50ml)5ml50ml)5ml，置，置44冰箱冰箱中保存。中保存。（3 3）方法：从克氏双糖）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，培养基上取菌，于于0.25ml0.25ml无菌生理无菌生理盐水中制成菌水中制成菌悬液，加液，加入甲苯并充分振入甲苯并充分振摇

36、，使，使酶释放。将放。将试管置管置37 37 水浴水浴5min5min，加入，加入0.25mlONPG0.25mlONPG试剂，水浴水浴20min320min3小小时观察察结果。果。(4)(4)结果：菌果：菌悬液呈液呈现黄色黄色为阳性反阳性反应，一，一般在般在202030min30min内内显色。色。(5)(5)应用：迅速及用：迅速及迟缓分解乳糖的分解乳糖的细菌菌ONPGONPG试验为阳性，而不阳性，而不发酵乳糖的酵乳糖的细菌菌为阴性。阴性。本本试验主要用于主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速酵乳糖菌株的快速鉴定。定。4七叶苷水解试验(1)(1)原理：有的原理：有的细菌可将七叶苷分解成菌可将七叶苷分

37、解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸中枸橼酸的二价酸的二价铁离子反离子反应，生成，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。黑色的化合物，使培养基呈黑色。(2)(2)培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。苷培养基。(3)(3)方法：将待方法：将待检菌接种于七叶苷培养菌接种于七叶苷培养基中，培养后基中，培养后观察察结果。果。(4)(4)结果：培养基果：培养基变为黑色黑色为阳性，不阳性，不变色者色者为阴性。阴性。(5)(5)应用：主要用于用：主要用于D D群群链球菌与其它球菌与其它链球菌的球菌的鉴别，前者阳性，后者阴，前者阳性，后者阴性。也可

38、用于革性。也可用于革兰阴性杆菌及阴性杆菌及厌氧氧菌的菌的鉴别。 5 5甲基甲基红试验(1)(1)原理：某些原理：某些细菌分解葡萄糖菌分解葡萄糖产生丙生丙酮酸，酸，进一步分解，一步分解，产生甲酸等，使生甲酸等，使pHpH降降至至4 45 5以下，加入甲基以下，加入甲基红试剂则呈呈红色色为阳性。若分解葡萄糖阳性。若分解葡萄糖产酸量少，酸量少，则pH pH 6 62 2以上，故加入甲基以上，故加入甲基红指示指示剂呈黄色，呈黄色，为阴性。阴性。(2)(2)培养基：葡萄糖蛋白培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。水培养基。(3)(3)方法：将待方法：将待检菌接种于上述培养基中，菌接种于上述培养基中，培养培养2-

39、4d2-4d，于培养基内加入甲基，于培养基内加入甲基红试剂，立即立即观察察结果。果。(4)(4)结果：呈果：呈现红色色为阳性；橘阳性；橘红色色为弱弱阳性；黄色阳性；黄色为阴性。阴性。(5)(5)应用：主要用于用：主要用于鉴别大大肠埃希菌与埃希菌与产气气肠杆菌，前者杆菌，前者为阳性，后者阳性，后者为阴性。阴性。此外此外肠杆菌科中沙杆菌科中沙门菌属、志菌属、志贺菌属、菌属、枸枸橼酸杆菌属、酸杆菌属、变形杆菌属等形杆菌属等为阳性，阳性，而而肠杆菌属杆菌属则为阴性。阴性。6V-P试验(1)(1)原理：某些原理：某些细菌分解葡萄糖菌分解葡萄糖产生丙生丙酮酸，酸，脱脱羧产生乙生乙酰甲基甲醇，在碱性甲基甲醇

40、，在碱性环境中境中被氧氧化被氧氧化为二乙二乙酰，进而与胍基起作用而与胍基起作用生成生成红色化合物，色化合物，则为V-PV-P试验阳性。阳性。(2)(2)培养基：葡萄糖蛋白培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。水培养基。 (3)(3)方法：将待方法：将待检菌接种于上述培养基中，菌接种于上述培养基中，于于35 35 培养培养48h48h后加入甲液后加入甲液(6(6nn萘酚酚酒精溶液酒精溶液) )和乙液和乙液(40(40KOHKOH溶液溶液) )，振，振摇。(4)(4)结果：在数分果：在数分钟内出内出现红色色为阳性；如阳性；如无无红色出色出现且于且于35 4h35 4h后仍如故者即后仍如故者即为阴性。阴性。(5)(5)应用：常与甲基用：常与甲基红试验一起使用，因一起使用，因为前者阳性的前者阳性的细菌，后者通常菌，后者通常为阴性。阴性。