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1、cre_loxp基因敲除系统背景介绍背景介绍1981年Evans等首次在体外分离和培养ES，成功建立了小鼠胚胎干细胞系1985年Smithies最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组（2）基因敲除机理Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation 基因敲除机理 （续）Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation二、基因敲除的基本流程（1）打靶载体构建Conditional KnockoutExon13NGT/AGAttention:（2）转化ES细胞 电穿孔或是显微注射
2、方法将构建好的打靶载体导入ES细胞电转需要的细胞数量2-5x107（3）阳性克隆筛选随机整合定点整合没有整合DTA(白喉毒素A亚基） （4）囊胚注射 小鼠的遗传背景取决于ES和囊胚细胞（5）嵌合体小鼠（6）品系纯化Loxp2小鼠品系建立完成纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种三、三、Cre工具鼠的构建工具鼠的构建 DNA显微原核注射，是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。诱导性组织特异性诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建工具鼠的载体构建 D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally
3、 regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001). MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain)Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599, G525R)MerCreMer融合蛋白融合蛋白 该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。 The End结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！19
