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1、5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的表达的影响影响 作者：杜雅冰，邵应举，樊青霞，孙桢，王琳，赵培荣 作者单位：(郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南郑州450002) 【摘要】目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细
2、胞株Eca9706，并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化，FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化，RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达，免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态，经5-Aza-CdR处理后，超甲基化状态解除，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率明显提高(P0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强，同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P0.05)。结论食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达，
3、当其超甲基化解除后，细胞增殖受到抑制，同时细胞凋亡率相应提高。 【关键词】 食管癌;组织因子途径抑制物-2;5-氮杂-2-脱氧胞苷;甲基化;免疫组化;逆转录聚合酶链反应;凋亡 ABSTRACT： ObjectiveTo explore the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine (5-Aza-CdR) intervention on the growth and proliferation of Eca9706 cell line and protein expression of tissue factor pathway inhibitor-2 (TFPI-2
4、). MethodsEca9706 cell line was treated by 5-azaCdR of different concentrations; MTT， flow cytometry， immunohistochemistry and RT-PCR were used to determine the cell growth， apoptosis， and the expression of TFPI-2 gene and its protein. ResultsEca9706 cell line had hypermethylation of TFPI-2. After d
5、emethylation by 5-Aza-CdR treatment， the proliferation of Eca9706 was inhibited， the apoptosis rate was also increased significantly in the concentration-dependent manner. RT-PCR detected that mRNA expression of TFPI-2 gene in Eca9706 cell line recovered significantly (P0.05). Conclusion5-Aza-CdR ca
6、n slow the growth of Eca9706 cell， increase the apoptosis rate， reactivate the TFPI-2 gene transcription and protein expression by demethylation. KEY WORDS： esophageal carcinoma; tissue factor pathway inhibitor-2; 5-Aza-CdR; methylation; immunohistochemistry; RT-PCR; apoptosis 组织因子途径移植物2(tissue fact
7、or pathway inhibitor， TFPI-2)是丝氨酸蛋白酶抑制物，在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。目前，关于TFPI-2在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少。本研究旨在探讨TFPI-2基因的失活机制，并寻找食管癌治疗的新靶点。 1材料与方法 1.1材料 RPMI-1640培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司;标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限公司;Trizol试剂购自MBI公司;RT-PCR试剂盒购自MBI公司;5-Aza-CdR购自Sigma公司;人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤生物学研究室惠赠。 1.2细胞培养和药物处理 人食管癌细胞Eca9706
8、以含10 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 、50 mL/L CO2培养箱培养，每23 d消化传代1次。 1.3MTT法检测干预前后细胞增长率的变化 取对数生长期细胞，调整密度至5104/mL接种于96孔板，按5-Aza-CdR浓度分为6组：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mol/L，每组复设5个孔。待细胞贴壁后，分别于24、48、72 h后加入MTT液，4 h后弃去上清液，每孔加DMSO 150 L，在490 nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A)。细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，
9、CPIR)按公式计算：CPIR=(1-实验组A均值/对照组A均值)100%。 1.4流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化 取对数生长期细胞，按5105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药，分组如下：对照组(0 mol/L),1.6 mol/L 5-Aza-CdR组，25.6 mol/L 5-Aza-CdR组，102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48 h后消化收集细胞，700 mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。 1.5RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达 分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48 h
10、。TFPI-2的上、下游引物分别为5-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3和5-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3，合成产物为440 bp;-actin作为内参照，上下游引物分别为5-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3和5-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3，合成产物为301 bp。按照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游产物进行PCR反应扩增目的基因。
11、反应条件为：94 预变性3 min，然后94 变性30 s,51 退火30 s,72 延伸30 s，循环30次，最后72 延伸5 min,4 保温。扩增片段经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.6免疫组化方法检测TFPI-2蛋白的表达 取对数生长期细胞，按5104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后加药(分组同RT-PCR)。培养48 h后加入40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10 min,100 mL/L动物血清封闭，室温下10 min，滴加1100的稀释的TFPI-2抗体4 过夜，二抗室温下1 h，滴加辣根酶标记链
12、霉卵白素，37 孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。另取爬片滴加PBS 液代替一抗作为阴性对照。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。光镜下随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1 000)100%。 1.7统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数标准差(x-s)表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准=0.05。 2结果 2.1干预前后细胞增长率的变化 经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作用
13、时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1不同浓度的5-aza-CdR对Eca9706细胞增殖的影响 2.2干预前后细胞凋亡率的变化 流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48 h后，Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%，与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组(1.390.27)%比较差异有统计学意义(P0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P0.05，图1)。以上实验重复5次。 2.3干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFP
14、I-2 mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2 mRNA在未用药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4 mol/L 5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2 mRNA表达，表明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2 mRNA表达逐渐增强(图2)。图1各组流式细胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6 mol/L 5-Aza-CdR组;C：25.6 mol/L 5-Aza-CdR组;D：102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。图25-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2 mRNA的表达M：DNA marker;-actin：30
15、1 bp;TFPI-2：440 bp;1：对照组;2：102.4mol/L组;3：25.6 mol/L组;4：1.6 mol/L组;5：H2O对照组。,2.4干预前后TFPI-2蛋白的表达情况免疫组化结果显示，经5-Aza-CdR作用Eca9706细胞48 h，TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6 mol/L组、25.6 mol/L组、102.4 mol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.101.42)%、(9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P0.05，图3)。图3各组TFP
16、I-2蛋白的表达情况 3讨论 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域，全长由8164个碱基组成，其cDNA全长为1 222 kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过80%1。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降2。有研究证实，在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关1,3-5。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清
17、楚，然而众多证据表明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一6-8。 目前，有体外实验表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能9。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca9706细胞中无表达，经过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。MIZUNO等10研究表明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高412倍，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据MTT实
18、验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析，DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂量呈正相关，推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关。进而通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加，并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等11在同等条件下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿
19、瘤细胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因为使TFPI-2重新表达的结果。 目前，国外以TFPI-2为药物研究靶点，就TFPI-2在肿瘤治疗、肿瘤临床诊断、促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用，也正在进行广泛深入的研究。本研究用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理人食管癌Eca9706细胞株，检测TFPI-2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响，以期寻找治疗肿瘤的新靶点。 【参考文献】 1HUBE F， REBERDIAU P， IOCHMANN S， et al. Character
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