基因组学第10PPT课件

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1、第第10章章 基因组表观遗传基因组表观遗传1) 什么是表观遗传什么是表观遗传2) 表观遗传现象表观遗传现象3) 表观遗传机制表观遗传机制 位置效应位置效应 副突变副突变 甲基化甲基化 基因组印记基因组印记 染色质重建染色质重建 剂量补偿剂量补偿表观遗传学的例子1) 1) 细胞的分化是一种典型细胞的分化是一种典型 2) 的表观遗传学现象的表观遗传学现象, 如人如人3) 类眼睛细胞和肌肉细胞含类眼睛细胞和肌肉细胞含4) 有相同的基因组有相同的基因组, 但基因但基因5) 的表达差异很大的表达差异很大.6)2) while a mutation in the axin gene called axin

2、-7)fused produces mice with kinky tails (弯曲尾弯曲尾巴巴), 8)the degree of kinkiness varies among genetically 9)identical littermates (同一窝老鼠同一窝老鼠)(Figure). Epigenetics的历史1) 上世纪上世纪40年代年代, Waddington首创首创“epigenetics” 一词一词, 用以概括用以概括研究基因及研究基因及其产物如何转变为表现型的领域其产物如何转变为表现型的领域. 用现在的用现在的话说话说, 就是遗传信息如何转变为表型的过程就是遗传信息如何

3、转变为表型的过程.2) 就词义而言就词义而言, “epi”是是“其上其上” (upon) 或或“超越超越” (over)的意思的意思. 因此因此, 在在epigenetics的定义中的定义中, genetics只涉及基因的结构层次只涉及基因的结构层次, 而而epigenetics则涉及基因如何发挥其功能以则涉及基因如何发挥其功能以及基因之间的互作关系及基因之间的互作关系.3) 在在Waddington的的“epigenetics”定义中定义中, epigenetics的位置处于遗传学的位置处于遗传学, 发育和生态学发育和生态学的交叉口的交叉口.表观遗传的通俗解释表观遗传的通俗解释我国古代有我国

4、古代有“橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，其实味不同相似，其实味不同”的记载，说明相同基因型的生物的记载，说明相同基因型的生物在不同的环境条件下表型有很大的差别。同一种中药在不同的环境条件下表型有很大的差别。同一种中药材在不同产地生长，其药效相差甚远，这也是环境影材在不同产地生长，其药效相差甚远，这也是环境影响基因表达的突出例子。这种因环境影响而改变的基响基因表达的突出例子。这种因环境影响而改变的基因表达模式并不涉及基因型的变异，但可以重复出现，因表达模式并不涉及基因型的变异，但可以重复出现，稳定遗传，是一种典型的表观遗传现象。稳定遗传，是一种典型的

5、表观遗传现象。同卵孪生子的表型趋异也是一种表观遗传同卵孪生子的表型趋异也是一种表观遗传. 最近的研究发最近的研究发现现, 随着年龄的增长同卵孪生子的表型差异有扩大的趋随着年龄的增长同卵孪生子的表型差异有扩大的趋势势.Epigenetics概念的变迁1) 1982年年“Dictionary of Biology”的定义的定义: epigenetics系系指指遗传因子与发育过程之间的互作遗传因子与发育过程之间的互作, 通过这种互作使基通过这种互作使基因型转变为表型因型转变为表型.2) 1992年年, Hall在其所著的在其所著的“Evolutionary Developmental Biology

6、”一书中一书中, 将将epigenetics定义为定义为: 在发育过程中遗在发育过程中遗传因子和非遗传因子作用于细胞传因子和非遗传因子作用于细胞, 选择性控制基因的表选择性控制基因的表达达, 并逐步增加表型复杂性的过程并逐步增加表型复杂性的过程.3) 1996年年, 在在“Epigentic Mechanisms of Gene Regulation”一书中将一书中将epigenetics定义为定义为: 不涉及不涉及DNA顺顺序的改变而发生的基因功能的差异序的改变而发生的基因功能的差异, 这种差异能通过有这种差异能通过有丝分裂和减数分裂稳定传递丝分裂和减数分裂稳定传递.4) 2001年年Sci

7、ence杂志对杂志对epigenetics的定义为的定义为: 不涉及不涉及DNA顺序的变异但能通过有丝分裂和减数分裂遗传的基因表顺序的变异但能通过有丝分裂和减数分裂遗传的基因表达模式的改变达模式的改变.表观遗传学表观遗传学表观遗传学表观遗传学(epigenetics):研究在研究在不改变不改变DNA顺序顺序的情况下基因表达的情况下基因表达出出现现可可遗遗传传变变化化的的分分支支学学科科. 这这种种表表达达模模式式的改变可通过有丝分裂和减数分裂传递给的改变可通过有丝分裂和减数分裂传递给子子代代细细胞胞或或个个体体. 表表观观遗遗传传学学是是功功能能基基因因组组学研究的重要领域学研究的重要领域.表

8、观遗传是基因组程序化的一种表现形式表观遗传是基因组程序化的一种表现形式.表观遗传表观遗传-位位 置置 效效 应应1) 位置效应位置效应是指由于是指由于基因在染色体上的位置发基因在染色体上的位置发 生改变而引起的表型改变的现象生改变而引起的表型改变的现象。2) 位置效应表明位置效应表明, 基因的功能以及基因对生物基因的功能以及基因对生物表表 型的影响可以在不改变遗传物质本身的顺型的影响可以在不改变遗传物质本身的顺 序组成情况下仅仅由于遗传物质在染色体上序组成情况下仅仅由于遗传物质在染色体上 的位置差别而发生变化的位置差别而发生变化。 3) 3) 位置效应实际上反映了基因组位置效应实际上反映了基因

9、组不同区域特定不同区域特定 染色质结构对基因施加的影响染色质结构对基因施加的影响。 两种位置效应美国学者美国学者E.B.E.B.刘易斯把位置效应分为两大刘易斯把位置效应分为两大类型：类型：稳定型和花斑型稳定型和花斑型。稳定型位置效应稳定型位置效应 简称简称S S型位置效应，表型型位置效应，表型 改变是稳定的。改变是稳定的。花斑型位置效应花斑型位置效应 简称简称V V型效应，其表型改型效应，其表型改 变是不稳定的，从而导致显性和隐性变是不稳定的，从而导致显性和隐性 性状嵌合的花斑现象。性状嵌合的花斑现象。 花斑型位置效应花斑型位置效应当某一基因由当某一基因由于染色体重排于染色体重排从原来的常染从

10、原来的常染色质区移到异色质区移到异染色质区附近染色质区附近, 因异染色质的因异染色质的扩散效应扩散效应, 造造成基因表达的成基因表达的改变改变. 这种抑这种抑制效应的差别制效应的差别使基因表达受使基因表达受抑程度不同抑程度不同,由此产生嵌合由此产生嵌合.位置效应-座位控制区1) 什么是座位控制区什么是座位控制区(locus control region , LCR). The level of activity of a euchromatic region of a chromosome is regulated by a cis-acting DNA element designated

11、a locus control region. 可调控常染色质区活性水平的一段顺式可调控常染色质区活性水平的一段顺式DNA成分成分.2) LCR的功能的功能:以顺式以顺式(cis-)方式调控与方式调控与其连锁的基因表达其连锁的基因表达.3) 第一个第一个LCR首先在人类首先在人类-球蛋白基因座球蛋白基因座位区发现位区发现.见见: Blood, 100:3077-3086, 2002-球蛋球蛋白质白质基因基因座位座位控制控制区区-球蛋白质基因座位控制区的结构球蛋白质基因座位控制区的结构球蛋白基因簇含有5个功能基因，分别为、G、A、,分布在50 kb的DNA区段。球蛋白基因只在血红细胞中表达，但每

12、个基因表达的时期与组织特异性各不相同。-球蛋白基因在胚胎卵囊中表达，G和A 卵黄囊表达，和仅在成体骨髓中表达。尽管每个球蛋白基因都有一套彼此独立的调控系统，但它们都毫无例外地受到位于该区上游一段长约12 kb的LCR控制.5HSs1-5是LCR区5个DNA-I酶高敏感位点,是处在开放状态的染色质区.5HSs1-4位点是类红细胞专一性的调控区, 5HSs5-7为非类红细胞活性. 增强子活性位于5HSs2-3位点. human hispanic deletion为LCR区缺失, 引起地中海贫血病. 卵圆型为气味受体基因区(olfactor receptor genes).LCR区ncRNA的调控作

13、用副突变副突变副突变:(paramuta-tion) 最初在最初在玉米中发现玉米中发现的的在杂合子在杂合子中某一基因中某一基因影响同一座影响同一座位上另一等位上另一等位基因的表位基因的表型型. 副突变副突变在转基因表在转基因表现型中也已现型中也已发现发现, 称为称为同源抑制同源抑制.副突变的分副突变的分子机制子机制控制玉米紫色基因控制玉米紫色基因b1副突副突变的成分位于该基因上游变的成分位于该基因上游100kb，是一段含有多个，是一段含有多个拷贝的重复顺序。杂合子拷贝的重复顺序。杂合子中已发生副突变的中已发生副突变的b1基因基因可将其修饰模式（可将其修饰模式（B）“拷贝拷贝”到等位基因到等位基

14、因B-1，使，使后者转变为副突变状后者转变为副突变状(B） B-I和和B都有都有7个串接重复顺序，重复顺序单位长个串接重复顺序，重复顺序单位长853 bp。重复顺序的多少。重复顺序的多少涉及副突变和涉及副突变和b1的转录水平。的转录水平。B-I和和B的的DNA顺序完全相同，不同的只是顺序完全相同，不同的只是表达水平。表达水平。B-I状态重复顺序的甲基化程度高于状态重复顺序的甲基化程度高于B.玉米的玉米的B-I和和B的副突的副突变涉及变涉及siRNA路线（路线（Alleman M等，等，2006）。）。 小RNA与玉米B-I基因的沉默染色质位置阻隔效应绝缘子1 1）19851985年，年，Udv

15、ardyUdvardy等在果蝇染色体等在果蝇染色体87A787A7条带热激蛋白基条带热激蛋白基 因座的两侧发现了两段取名为因座的两侧发现了两段取名为scs scs 和和 scs scs (specialized chronatin structures, (specialized chronatin structures, 特化染色质区特化染色质区) ) 的顺序。的顺序。scsscs和和scsscs长分别为长分别为350 bp 350 bp 和和 200 bp 200 bp，对，对 DNAase I DNAase I 有高度抗性。这两个序列的两侧均有有高度抗性。这两个序列的两侧均有DNAase

16、 DNAase I I超敏位点，各为超敏位点，各为100 bp100 bp。2 2）将）将scsscs置于控制眼睛颜色的基因两侧然后导入果蝇，转置于控制眼睛颜色的基因两侧然后导入果蝇，转 化的果蝇品系不管转基因位于何处，均可产生类似表化的果蝇品系不管转基因位于何处，均可产生类似表 型，说明型，说明scsscs可使转基因免受内源染色质可使转基因免受内源染色质“位置影位置影 响响”3) 3) 这种可以阻止邻近位置激活或失活效应的顺序称之为这种可以阻止邻近位置激活或失活效应的顺序称之为绝绝 缘子缘子（insulatorinsulator）或）或隔离子隔离子。 果蝇绝缘子（insulator） 果蝇多

17、线染色体横纹区果蝇多线染色体横纹区SCSSCS专一性结合蛋白质专一性结合蛋白质绝缘子可阻止相邻基因之间增强绝缘子可阻止相邻基因之间增强子的彼此干扰子的彼此干扰1) 真核生物增强子具有双向作用真核生物增强子具有双向作用, 超长距离功超长距离功 能能, 从而带来位置相邻基因之间的彼此干扰从而带来位置相邻基因之间的彼此干扰 问题问题.2) 有些基因位于异染色质邻近有些基因位于异染色质邻近, 会受到抑制效应会受到抑制效应的干扰的干扰.绝缘子可以阻止上述因位置原因产生的对基因表绝缘子可以阻止上述因位置原因产生的对基因表达的抑制效应达的抑制效应.绝缘子的定向控制 绝缘子效应的方向性绝缘子的效应具有方向性绝

18、缘子的效应具有方向性 果蝇的果蝇的yellow（y）座位有）座位有4个个增强子元件，增强子元件，2个位于启动子上游，另个位于启动子上游，另2个位于外显子个位于外显子1和和2之间，它们分别负责不同组织特异性的之间，它们分别负责不同组织特异性的yellow基因的表基因的表达。将含有绝缘子的果蝇逆转录转座子达。将含有绝缘子的果蝇逆转录转座子gypsy依次分别插依次分别插入每个增强子元件的附近，绝缘子对增强子的阻隔效应入每个增强子元件的附近，绝缘子对增强子的阻隔效应依位置不同而异依位置不同而异: 1) 如果插入位置在启动子的如果插入位置在启动子的5方向，将影响绝缘子上游方向，将影响绝缘子上游 增强子元

19、件的作用增强子元件的作用。2) 如果插入位置在启动子的如果插入位置在启动子的3方向，只影响下游增强子方向，只影响下游增强子 元件的功能元件的功能。3) 如果插入位置不在增强子与启动子之间，绝缘子对增如果插入位置不在增强子与启动子之间，绝缘子对增 强子无阻隔效应强子无阻隔效应。 绝缘子（2） 绝缘子结合蛋白（CTCF）（1） 绝缘子DNA结合蛋白一种一种DNA-结合蛋白结合蛋白CTCF(CCCTC-binding factor, CCCTC结合因子结合因子)可专一性与该可专一性与该42 bp顺序结合。顺序结合。CTCF已在其它实已在其它实验中被证明参与基因的转录激活与沉默，是一个含有验中被证明参

20、与基因的转录激活与沉默，是一个含有11个个锌指的分子量为锌指的分子量为82 kD的蛋白质。人体的蛋白质。人体T细胞受体细胞受体/座位座位及爪蟾（及爪蟾（Xenopus）RO (repeat organizer, 重复顺序组织者重复顺序组织者) rRNA基因调控区绝缘子均有保守的基因调控区绝缘子均有保守的CTCF结合位点结合位点 (Bell, 2001)。这些在进化上处于不同地位的物种中广泛存在绝缘。这些在进化上处于不同地位的物种中广泛存在绝缘子的现象表明，以绝缘子界定增强子的作用范围是真核基子的现象表明，以绝缘子界定增强子的作用范围是真核基因组一种普遍的控制基因活性的机制因组一种普遍的控制基因

21、活性的机制 绝绝缘缘子子与与果果蝇蝇BX-CBX-C基基因因调调控控果蝇腹节模式决定区中的绝缘子染色质修饰与重建染色质修饰与重建 增强子作用的DNA环化模型与绝缘子的关系高等生物基因组普遍存在甲基化1) DNA1) DNA分子的化学修饰主要是甲基化，分子的化学修饰主要是甲基化，脊椎动物基脊椎动物基因因组中约组中约60-80%60-80%双核苷酸双核苷酸CpGCpG的胞嘧啶的胞嘧啶(C)(C)被甲基被甲基化。化。被子植物基因组被子植物基因组中，甲基化位置主要出现在中，甲基化位置主要出现在CpGCpG和和CpNpGCpNpG回文对称顺序，大约回文对称顺序，大约20-30%20-30%的胞嘧啶的胞嘧

22、啶(C)(C)被甲基化。被甲基化。DNADNA的甲基化在基因的表达调控中的甲基化在基因的表达调控中起重要作用。起重要作用。2 2） 基因组的甲基化模式可影响表型并能通过体细胞基因组的甲基化模式可影响表型并能通过体细胞遗传遗传，但不该变细胞的基因型，但不该变细胞的基因型. . 基因组的甲基化基因组的甲基化是表观遗传的重要内容之一是表观遗传的重要内容之一. .3) 3) 基因组基因组DNADNA甲基化是基因表达调控的重要方式甲基化是基因表达调控的重要方式, , 并并与染色体重建与染色体重建(chromatin remodeling)(chromatin remodeling)有关有关. .DNA去

23、甲基化与肌肉细胞分化基因组DNA甲基化的生物学1）细胞命运的确定与基因组）细胞命运的确定与基因组DNA的甲基的甲基 化状态有关；化状态有关；2）DNA甲基化是决定基因表达模式的重甲基化是决定基因表达模式的重 要因素；要因素；3）DNA甲基化模式可以在上下代细胞之甲基化模式可以在上下代细胞之 间传递；间传递；4）DNA甲基化只限于碱基的修饰，并不甲基化只限于碱基的修饰，并不 改变改变DNA的顺序组成。的顺序组成。 染色质重建染色质重建1)染色质重建染色质重建(chromatin remodeling)系指系指染色体结构状态的改变染色体结构状态的改变.染色质重建可以染色质重建可以是可逆的是可逆的,

24、也可以是不可逆的也可以是不可逆的.2)染色质重建涉及染色质重建涉及DNA的甲基化的甲基化, 组蛋白组蛋白的乙酰基化和去乙酰基化的乙酰基化和去乙酰基化.3)染色质重建的目的是使染色质的物理状染色质重建的目的是使染色质的物理状态处于松弛或收缩态处于松弛或收缩, 其结果使转录活化因其结果使转录活化因子可接触或不能接触调控顺序子可接触或不能接触调控顺序.DNA甲基化与染色质重建siRNA可诱导异染色质形成见见:Current Opinion in Cell Biology 16:230-238, 2004siRNA介导的染色质沉默 DNA甲基化与转座子活性染色质结构的不可逆变化与基因沉默在个体发育与细

25、胞分化过程中，当某些基因已经完成预在个体发育与细胞分化过程中，当某些基因已经完成预定的表达程序后必需永久性关闭。这一任务可以通过定的表达程序后必需永久性关闭。这一任务可以通过DNA甲基化促使染色质的重建完成。甲基化促使染色质的重建完成。Polycome:多结蛋白多结蛋白. DNA甲基化抑制转座等位基因成员的非对称表达等位基因成员的非对称表达1) 二倍体基因组中每个等位基因均有两个二倍体基因组中每个等位基因均有两个等位基因成员等位基因成员.2)二倍体每个等位基因成员的表达模式有二倍体每个等位基因成员的表达模式有三种三种: 母源基因表达母源基因表达, 父源基因表达父源基因表达, 两个成员两个成员均

26、表达均表达3) 有三种机制决定等位基因成员的非对称有三种机制决定等位基因成员的非对称表达表达: 1.X-染色体失活染色体失活; 2.基因组印记基因组印记; 3.随机选择随机选择.基因组印记1)19911)1991年年TM.TM.德切艾拉等报道德切艾拉等报道, , 老鼠老鼠7 7号染色体上中有一个号染色体上中有一个称为类胰岛素生长因子称为类胰岛素生长因子Igf2Igf2的基因的基因(insulin-like growth factorII), ,该基因的突变纯合子表现为侏儒症该基因的突变纯合子表现为侏儒症. .在杂合子在杂合子中中, ,如果突变等位基因来自父亲如果突变等位基因来自父亲, , 表型

27、异常表型异常. .如果来自母如果来自母亲亲, ,表型正常表型正常, ,即母源即母源Igf2Igf2基因在子代被抑制基因在子代被抑制. .2) 2) 这种这种因为亲本来源不同而使等位基因表达模式发生改因为亲本来源不同而使等位基因表达模式发生改变的现象称为印记变的现象称为印记(imprinting). .它有两个特点它有两个特点: : 1.1.子代的两个等位基因中有一个发生沉默子代的两个等位基因中有一个发生沉默, , 即不表达即不表达. . 2. 2.哪一个等位基因沉默取决于哪一个等位基因沉默取决于等位基因的亲本来源等位基因的亲本来源. . 这是在哺乳动物中最早发现的表观遗传现像这是在哺乳动物中最

28、早发现的表观遗传现像. . 随后又在老随后又在老鼠中发现另外一个基因鼠中发现另外一个基因, , 即即7 7号染色体上与号染色体上与Igf2Igf2紧密连锁紧密连锁的的H19H19也有类似的情况也有类似的情况, , 只是表现相反只是表现相反, , 即父源的即父源的H19H19等位等位基因在子代中不表达基因在子代中不表达, , 母源的母源的H19H19基因在子代中正常表达基因在子代中正常表达. . 基因组印记的分子机制绵羊肥臀突变的遗传符合典型的绵羊肥臀突变的遗传符合典型的基因组印记模式基因组印记模式In 1996, a team led by Cockett and Georges In 199

29、6, a team led by Cockett and Georges explained what was going on: explained what was going on: Only lambs Only lambs that inherit the callipyge mutation from that inherit the callipyge mutation from their fathertheir father but but not their mothernot their mother develop develop the traitthe trait.

30、 All other combinations of . All other combinations of normal and callipyge chromosomes result in normal and callipyge chromosomes result in normal sheep. The researchers named the normal sheep. The researchers named the effect polar overdominance (effect polar overdominance (极性超显性效应极性超显性效应).).见见: T

31、rends in Genetics 19:248-252, 2003.基基因因组组印印记记的的其其它它例例子子DNA甲基化与基因组程序化 受受精精胚胚与与体体细细胞胞胚胚的的发发育育差差异异哺乳动物哺乳动物体细胞胚体细胞胚胎发与受胎发与受精卵胚胎精卵胚胎发育存在发育存在许多异许多异.这这些差异主些差异主要表现在要表现在体细胚与体细胚与受精胚基受精胚基因组的程因组的程序化序化. 受精受精胚的雄核与胚的雄核与雌核在去甲雌核在去甲化的程序上化的程序上存在时间差存在时间差.甲化程序的甲化程序的差异会导致差异会导致胎发育异常胎发育异常.双卵融合克隆小鼠 哺乳动物均有基因组印记哺乳动物均有基因组印记, ,

32、 因此哺乳动物没有孤雌生殖因此哺乳动物没有孤雌生殖. . 只有将野生型只有将野生型H19H19基因和突变型基因和突变型H19H19基因的卵细胞融合才得到成体克隆鼠基因的卵细胞融合才得到成体克隆鼠. . 见见: :Nature 428:860-864,2004Nature 428:860-864,2004剂量效应剂量效应1) 剂量效应系指具有两份基因拷贝的个体剂量效应系指具有两份基因拷贝的个体和一份基因拷贝的个体在表现型上保持和一份基因拷贝的个体在表现型上保持一致的机理一致的机理. 2) 多细胞生物中性别染色体在雌性和雄性多细胞生物中性别染色体在雌性和雄性细胞中的拷贝数不同细胞中的拷贝数不同,

33、为平衡基因表达为平衡基因表达产物的数量产物的数量, 出现整条染色体被抑止或出现整条染色体被抑止或超激活现象超激活现象.染染色色体体剂剂量量效效应应染色体剂量效染色体剂量效应可通过基因应可通过基因的上调或下调的上调或下调形式达到形式达到: 1) 哺乳动物雌哺乳动物雌性一条性一条X-染色染色体失活体失活,形成形成Barr小体小体;2) 果蝇雄性果蝇雄性X-染色体超表达染色体超表达以达到平衡以达到平衡;3) 线虫雌性一线虫雌性一条条X-染色体低染色体低表达表达.X- -染染色色体体失失活活机机制制雌性老鼠在胚胎早雌性老鼠在胚胎早期两个期两个XIST等位基等位基因低水平表达因低水平表达, 但但RNA产

34、物不稳定产物不稳定,并与其编码基因结并与其编码基因结合合. 随着发育进行随着发育进行,其中一个其中一个XIST基因基因的表达逐步稳定最的表达逐步稳定最终覆盖了其所在的终覆盖了其所在的整个整个X-染色体染色体. 另另一一X-染色体上的染色体上的XIST基因则随之因基因则随之因启动子甲基化而关启动子甲基化而关闭闭. 选择那条选择那条X-染染色体失活是一个随色体失活是一个随机的过程机的过程.干细胞与表观遗传人类皮肤细胞诱导成胚胎多能干细胞美日两国研究小组美日两国研究小组2007年年11月月20日分别在两家权威科学日分别在两家权威科学杂志发表相关研究报告杂志发表相关研究报告, 宣称成功将人类皮肤细胞诱

35、导宣称成功将人类皮肤细胞诱导成多能干细胞成多能干细胞, 即即iPS (induced pluripotent stem) 。美国威斯康星大学詹姆斯美国威斯康星大学詹姆斯汤姆森实验室的研究发表在汤姆森实验室的研究发表在科学杂志，而日本京都大学教授山中伸弥领导的科学杂志，而日本京都大学教授山中伸弥领导的研究小组把报告发表在细胞杂志。研究小组把报告发表在细胞杂志。 两个小组的研究方法和原理大同小异。山中伸弥研究小两个小组的研究方法和原理大同小异。山中伸弥研究小组从一名组从一名36岁女性的脸部提取了科学家称为纤维原细岁女性的脸部提取了科学家称为纤维原细胞的皮肤细胞。詹姆斯胞的皮肤细胞。詹姆斯汤姆森实验

36、室的皮肤细胞来汤姆森实验室的皮肤细胞来自一名新生儿的阴茎包皮细胞。自一名新生儿的阴茎包皮细胞。詹姆斯詹姆斯汤姆森实验室的旅美华人女科学家俞君英参与汤姆森实验室的旅美华人女科学家俞君英参与了这次皮肤干细胞的研究。了这次皮肤干细胞的研究。学界评价这一突破可能意味着风靡一时的胚胎干细胞克学界评价这一突破可能意味着风靡一时的胚胎干细胞克隆技术将退出舞台。隆技术将退出舞台。俞君英在汤姆森实验室内进行有关干细胞的试验 基因组程序化与胚胎干细胞基因组程序化与胚胎干细胞1) 1) 什么是胚胎干细胞什么是胚胎干细胞? ?2) 2) 胚胎干细胞的医学意义胚胎干细胞的医学意义3) 3) 如何获取胚胎干细胞如何获取胚

37、胎干细胞? ?4) 4) 人类胚胎干细胞获取的困难人类胚胎干细胞获取的困难5) 5) 从人体体细胞诱导胚胎干细从人体体细胞诱导胚胎干细 胞的可能性胞的可能性6) 6) 哺乳动物体细胞重新程序化哺乳动物体细胞重新程序化(reprogramming)(reprogramming)人类iPS细胞的培育过程1) 筛选与克隆控制胚胎干细胞基因组重新筛选与克隆控制胚胎干细胞基因组重新程序化的基因程序化的基因.2) 把把4种基因注入皮肤细胞，这些特定基因种基因注入皮肤细胞，这些特定基因能够能够“重组重组”皮肤细胞的基因皮肤细胞的基因.3) 将普通人体皮肤细胞成功改造成干细胞将普通人体皮肤细胞成功改造成干细胞

38、.4) 培育器官从理论上讲，这种干细胞的功培育器官从理论上讲，这种干细胞的功能类似通过胚胎克隆技术取得的胚胎干能类似通过胚胎克隆技术取得的胚胎干细胞，能够最细胞，能够最 终培育成人体组织或器官终培育成人体组织或器官.灵长类胚胎干细胞灵长类胚胎干细胞Thomson JA对灵长类胚胎干细胞所给出的定对灵长类胚胎干细胞所给出的定义特征如下义特征如下:1) 来自未植入子宫之前的胚胎来自未植入子宫之前的胚胎;2) 可以无限保持未分化及增生状态可以无限保持未分化及增生状态;3) 即使在培养之后仍然可以稳定地发育成胚即使在培养之后仍然可以稳定地发育成胚胎的三个胚层胎的三个胚层, 具有多向分化的潜能具有多向分

39、化的潜能.见见: Science 282, 1998胚胎的特征及发育全能性干细胞所应具有的特征1) 来源于一个全能性的细胞群体来源于一个全能性的细胞群体;2) 具有正常的细胞核型具有正常的细胞核型;3) 具永生性具永生性,半场在胚胎状态下能无限制半场在胚胎状态下能无限制的分裂的分裂;4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（发分化成胚胎外组织（extraembryonic tissues）和分属所有）和分属所有3种胚层的体细胞种胚层的体细胞此前所有已培养成功的哺乳动物细胞中，此前所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物除小鼠外，灵

40、长类动物ES细胞只满足细胞只满足上述上述4条标准的前条标准的前3条。条。 体细胞可以逆转成为胚胎干细胞1) 就基因组的遗传信息组成而言就基因组的遗传信息组成而言, 每个体细每个体细 胞都具备潜在的可能胞都具备潜在的可能.2) 因为体细胞是胚胎发育与形态建成的终极产物因为体细胞是胚胎发育与形态建成的终极产物, 自然状态下这是一个屗可逆的过程自然状态下这是一个屗可逆的过程3) 胚胎发生与细胞分化是基因组程序化的结果胚胎发生与细胞分化是基因组程序化的结果,体细胞要逆转为胚胎干细胞必需重新程序化体细胞要逆转为胚胎干细胞必需重新程序化.4) 因体细胞核移植到卵细胞中可以获得类似自然因体细胞核移植到卵细胞

41、中可以获得类似自然受精发育的胚胎受精发育的胚胎, 在卵细胞中必定存在使基因在卵细胞中必定存在使基因组重新程序化的因子组重新程序化的因子.5) 将基因组重新程序化的因子导入体细胞可以使将基因组重新程序化的因子导入体细胞可以使体细胞命运逆转体细胞命运逆转, 产生具有多能分化的干细胞产生具有多能分化的干细胞.几个关键的步骤1) 1) 基因组重新程序化基因的筛选基因组重新程序化基因的筛选2) 2) 基因组重新程序化基因的转化基因组重新程序化基因的转化3) 3) 转化细胞的筛选与鉴定转化细胞的筛选与鉴定4) iPS4) iPS细胞的功能验证细胞的功能验证常规胚胎干细胞的获取及培养诱导哺乳动物体细胞转变为

42、胚胎干细胞1) 根据核移植可以判断卵细胞中含有促使根据核移植可以判断卵细胞中含有促使体细胞基因组重新程序化的因子体细胞基因组重新程序化的因子.2) 胚胎干细胞可以持续维持多能分化的潜胚胎干细胞可以持续维持多能分化的潜力力, 表明有控制胚胎干细胞属性表明有控制胚胎干细胞属性(identity)的遗传因素的遗传因素.3) 分离与鉴定与胚胎干细胞生成与维持的分离与鉴定与胚胎干细胞生成与维持的基因是逆转体细胞程序化的前提基因是逆转体细胞程序化的前提.寻找决定胚胎干细胞命运的基因寻找决定胚胎干细胞命运的基因1) Yamanaka等选择等选择24个在胚胎干细胞和肿瘤个在胚胎干细胞和肿瘤细胞中表达上调的基因

43、作为胚胎干细胞决定细胞中表达上调的基因作为胚胎干细胞决定候选基因候选基因.2) 将上述基因构建到逆转录病毒表达载体中将上述基因构建到逆转录病毒表达载体中,它它们处于们处于Fbx15基因的调控顺序下游基因的调控顺序下游, 并将它们并将它们转化老鼠胚胎成纤维细胞转化老鼠胚胎成纤维细胞(MEF).3) Fbx15基因是胚胎干细胞专一性表达的基因是胚胎干细胞专一性表达的.4) 实验结果证实单个外源基因的导入不能获得实验结果证实单个外源基因的导入不能获得胚胎成纤维细胞的逆转胚胎成纤维细胞的逆转, 但组合的转化可产但组合的转化可产生具有胚胎干细胞形态特征的细胞生具有胚胎干细胞形态特征的细胞, 这些细这些细

44、胞被称为胞被称为iPS(induced pluripotent stem)细胞细胞.见: Cell 126:663-676, 2006胚胎干细胞命运决定基因筛选策略胚胎干细胞决定基因的筛选1) 上述小组在上述小组在10个基因组合产生个基因组合产生MEF细胞逆转细胞逆转的基础上的基础上,采取排除法确定采取排除法确定4个基因为个基因为MEF细细胞逆转所必需胞逆转所必需, 分别为分别为: Oct3/4, Klf4, Sox2和和c-Myc.2) 在这初筛的在这初筛的4个基因中任意缺失一个基因个基因中任意缺失一个基因,均均不能产生类胚胎干细的特征不能产生类胚胎干细的特征.因此这因此这4个基因个基因是最

45、低要求的逆转是最低要求的逆转MEF细胞的因子细胞的因子.3) Oct3/4, Klf4, Sox2和和c-Myc四个基因转化的四个基因转化的MEF细胞可促使细胞可促使Fbx15和和Nanog基因的表达基因的表达.4) Fbx15和和Nanog基因的表达可作为筛选基因的表达可作为筛选iPS细细胞的标记胞的标记.iPS细胞功能的验证1) iPS-MEF细胞系具有类似天然胚胎干细细胞系具有类似天然胚胎干细胞的形态特征胞的形态特征.2) iPS-MEF细胞系的细胞系的Oct3/4和和Nanog基因基因的启动子区核小体组蛋白的乙酰基化和的启动子区核小体组蛋白的乙酰基化和K9的甲基化以及的甲基化以及CpG

46、双碱基甲基化模式双碱基甲基化模式与胚胎干细胞类似与胚胎干细胞类似.3) iPS-MEF细胞系的细胞系的DNA芯片杂交检测基芯片杂交检测基因表达譜也与胚胎干细胞类似因表达譜也与胚胎干细胞类似.4) 将将iPS-MEF细胞系注入到裸鼠皮下细胞细胞系注入到裸鼠皮下细胞可产生畸胎瘤可产生畸胎瘤, 表明具有胚胎干细胞特表明具有胚胎干细胞特征征.iPS-MEF具多向分化潜能将将iPS-MEF转化转化细胞注入细胞注入到裸鼠皮到裸鼠皮下组织后下组织后可产生的可产生的畸胎瘤含畸胎瘤含有不同的有不同的组织细胞组织细胞,具多向分具多向分化潜能化潜能.逆转的老鼠胚胎成纤维细胞具多向分化潜能Nanog更适合iPS细胞筛

47、选因为以因为以Fbx15为为标记筛选的标记筛选的iPS-MEF与天然老与天然老鼠囊胚混合后鼠囊胚混合后不能生成嵌合不能生成嵌合成体成体, 其胚胎干其胚胎干细胞潜能竞争细胞潜能竞争力差力差. 实验证明实验证明Nanog更适合更适合.Nanog更适合iPS细胞筛选以以Nanog为为标记的筛选标记的筛选可获得具有可获得具有细胞增生的细胞增生的iPS及畸胎及畸胎瘤分化的胚瘤分化的胚胎干细胞胎干细胞.转化人类皮肤细胞为胚胎干细胞Yu等的研究如下等的研究如下:1) 选择选择14个涉及胚胎干细胞形成与维持相个涉及胚胎干细胞形成与维持相关的基因构建到逆转录病毒载体中转化关的基因构建到逆转录病毒载体中转化体细胞

48、体细胞.2) 根据不同的基因组合转化体细胞为胚胎根据不同的基因组合转化体细胞为胚胎干细胞效果干细胞效果, 确定确定4个基因即个基因即Oct4, Sox2, Nanog和和Lin28足以转化体细胞为胚胎足以转化体细胞为胚胎干细胞干细胞.3) 由人类皮肤体细转化为胚胎干细胞的验由人类皮肤体细转化为胚胎干细胞的验证证.由人类皮肤体细转化为由人类皮肤体细转化为胚胎干细胞的验证胚胎干细胞的验证1) iPS细胞具有人类自然胚胎干细胞的形态细胞具有人类自然胚胎干细胞的形态.2) iPS细胞具有正常的核型细胞具有正常的核型.3) 具端粒酶活性具端粒酶活性.4) 细胞表面膜蛋白标记与自然胚胎干细胞相同细胞表面膜

49、蛋白标记与自然胚胎干细胞相同.5) 基因表达譜相一致基因表达譜相一致.6) Oct4启动子启动子甲基化模式甲基化模式与自然胚胎干细胞相似与自然胚胎干细胞相似.7) 具有发育成三胚层细胞的潜能具有发育成三胚层细胞的潜能, 来自来自iPS细胞细胞的的 畸胎瘤可分化为多种组织细胞畸胎瘤可分化为多种组织细胞.畸胎瘤的分化畸胎瘤的分化iPS细胞系接种到裸鼠肌肉组织产生畸胎瘤并分细胞系接种到裸鼠肌肉组织产生畸胎瘤并分化出不同的组织细胞化出不同的组织细胞: 左左, 神经细胞神经细胞, 内胚层发育内胚层发育;右右, 肠道细胞肠道细胞, 内胚层发育内胚层发育.iPS细胞具有癌症倾向1) iPS细胞可与天然小鼠胚

50、胎囊胚期细胞细胞可与天然小鼠胚胎囊胚期细胞混合并参于胚胎发育长成成年个体混合并参于胚胎发育长成成年个体.2) 含有含有iPS来源的小鼠个体有一定的比例来源的小鼠个体有一定的比例产生癌症产生癌症.3) 产生癌症的原因产生癌症的原因: 1, LTR载体的影响载体的影响; 2, c-Myc基因具有癌变的潜能基因具有癌变的潜能.4) 路漫漫兮其修远路漫漫兮其修远, .产生iPS细胞的多种方法Nature Biotechnology, 26:1246, 2008干细胞重新程序化方法比较染色质重建与基因转录基因转录时要以编码基因转录时要以编码DNA为模板合成为模板合成mRNA前体前体, 但但DNA分子缠绕

51、在核小体上分子缠绕在核小体上, 因此必需使因此必需使DNA离开核小体离开核小体.染色质的结构染色质重建依赖于组蛋白的修饰染色质重建依赖于组蛋白的修饰1) 核小体的修饰是染色质水平进行基因表核小体的修饰是染色质水平进行基因表达调控的中心环节达调控的中心环节.2) 核小体修饰的目的是促使核小体核心核小体修饰的目的是促使核小体核心8聚体与聚体与DNA分子的结合或者松弛或者强分子的结合或者松弛或者强化化, 便于核小体移动或固定便于核小体移动或固定, 使转录调控使转录调控因子结合或排斥因子结合或排斥.组蛋白的修饰组蛋白的修饰目前已发现的组蛋白修饰目前已发现的组蛋白修饰:1) 乙酰基化乙酰基化(可逆可逆)

52、2) 甲基化甲基化(不可逆不可逆)3) 类泛素化类泛素化(可逆可逆)4) Sumoylation(可逆可逆)5) 磷酸化磷酸化(可逆可逆)RNAi可介导组蛋白修饰可介导组蛋白修饰SUMO: small ubiquitin-likemodifier, 泛素样小修饰蛋白泛素样小修饰蛋白见见: Cell 116:259-272, 2004 (重要参考文重要参考文献献)核小体核小体组蛋白空间分布组蛋白修饰组蛋白修饰乙酰基化和去乙酰基化乙酰基化和去乙酰基化组蛋白的修饰乙酰基化组蛋白乙酰基化是基因在染色质水平表达调控的主要方式之组蛋白乙酰基化是基因在染色质水平表达调控的主要方式之一一. 组蛋白乙酰基化使其

53、与组蛋白乙酰基化使其与DNA的结合松弛的结合松弛, 利于核小体位移利于核小体位移.组蛋白甲基化组蛋白甲基化组蛋白的甲基化是不可逆的组蛋白的甲基化是不可逆的, 直接参与染色质的表观遗传直接参与染色质的表观遗传.甲甲基化主要出现在基化主要出现在lys位置位置, 有抑制和激活两种不同的效应有抑制和激活两种不同的效应.染色质疆域染色质疆域人类成纤维细胞和人类成纤维细胞和人类成纤维细胞和人类成纤维细胞和羊水细胞有丝分裂羊水细胞有丝分裂羊水细胞有丝分裂羊水细胞有丝分裂前中期染色体的有前中期染色体的有前中期染色体的有前中期染色体的有序分布序分布序分布序分布small chromosomes independ

54、ently of their gene densitywere distributed significantly closer to the center of the nucleus or prometaphase rosette, while large chromosomes were located closer to the nuclear or rosette rim.Chromatin domains, which are gene-poor, form a layer beneath the nuclear envelope, while gene-dense chromat

55、in is enriched in the nuclear interior. PLoS Biol 3(5): e157, 2005活性基因与沉默基因的空间位置活性基因与沉默基因的空间位置常染常染色质色质与异与异染色染色质在质在细胞细胞核中核中的分的分布布思思 考考 题题 1.什么是表观遗传什么是表观遗传? 表观遗传包括哪些内容表观遗传包括哪些内容? 举例说明举例说明. 2.什么是位置效应什么是位置效应? 有哪两种位置效应有哪两种位置效应?. 3.基因组如何阻止相邻基因之间调控顺序的干扰基因组如何阻止相邻基因之间调控顺序的干扰?. 4.何谓基因组印记何谓基因组印记? 它是如何产生的它是如何产生的? 5.胚胎发育中基因组重新程序化出现在什么阶段胚胎发育中基因组重新程序化出现在什么阶段? 有何有何 特征特征? 6.有什么实验证明有什么实验证明DNA甲基化与基因的表达调控有关甲基化与基因的表达调控有关? 7.DNA甲基化与染色质重建有何联系甲基化与染色质重建有何联系? 8.DNA甲基化的生物学意义甲基化的生物学意义? 9.核小体组蛋白有哪些修饰方式核小体组蛋白有哪些修饰方式? 组蛋白修饰促使染色组蛋白修饰促使染色 质松弛的原因是什么质松弛的原因是什么?10.什么是剂量补偿什么是剂量补偿? 果蝇与哺乳动物剂量补偿机制有何果蝇与哺乳动物剂量补偿机制有何不同不同?