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1、呼吸道病毒标本采集运输、保存呼吸道病毒标本采集运输、保存与实验室结果判读与实验室结果判读1相关相关呼吸道病毒概况呼吸道病毒概况22024/7/29呼吸道病毒呼吸道病毒 呼呼吸吸道道病病毒毒是是指指一一大大类类能能侵侵犯犯呼呼吸吸道道引引起起呼呼吸吸道道局局部部病病变变，或或仅仅以以呼呼吸吸道道为为入入侵侵门门户户，主主要要引引起起呼呼吸吸道道外外组组织织器器官官病病变变的的病病毒毒。拒拒统统计计，90%90%以上的急性以上的急性上上呼吸道感染由病毒引起。呼吸道感染由病毒引起。32024/7/29呼吸道病毒的分类呼吸道病毒的分类l正粘病毒科正粘病毒科 流感病毒流感病毒（A、B、C）l副粘病毒科副
2、粘病毒科 副流感病毒副流感病毒（I-IV）、）、呼吸道合胞病呼吸道合胞病毒毒、 偏肺炎病毒偏肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒 l小小RNA病毒科病毒科 肠道病毒（脊髓灰质炎病毒、肠道病毒（脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒柯萨奇病毒、埃埃可病毒可病毒）、鼻病毒、心病毒、鼻病毒、心病毒l腺病毒科腺病毒科 腺病毒腺病毒l冠状病毒科冠状病毒科 SARS-CoV, 229E, OC43, NL63, HKU1l细小病毒细小病毒 博卡病毒博卡病毒（1-4）l呼肠孤病毒科呼肠孤病毒科 正呼肠孤病毒属正呼肠孤病毒属l疱疹病毒科疱疹病毒科 单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病
3、毒病毒 水痘带状疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、l披膜病毒科披膜病毒科 风疹病毒风疹病毒l多瘤病毒多瘤病毒 WU、KI42024/7/29呼吸道病毒感染的特点呼吸道病毒感染的特点l病毒的多样性和变异性；病毒的多样性和变异性；l在在引引起起成成人人感感冒冒的的病病毒毒群群中中：鼻鼻病病毒毒占占30%-35%，冠冠状状病病毒毒占占20%-30%，其他病毒占，其他病毒占10%-15%。l大大部部分分情情况况下下，病病毒毒入入侵侵部部位位、入入侵侵后后繁繁殖殖部部位位、由由此此引引发发的的组组织织和和免免疫疫病病理理改改变变以以及及表表现现出出的的临临床床症症状状和和体体征征的的部部位位基基本本在在呼呼吸
4、吸道道，表现的病情较轻；表现的病情较轻；l一般无病毒血症；一般无病毒血症；l有些病毒还可引起肠道感染；有些病毒还可引起肠道感染；l免疫力不持久；免疫力不持久；52024/7/29正粘病毒的基本特征流行性感冒病毒（简称流感病毒）流行性感冒病毒（简称流感病毒）： 是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科理化特性：理化特性： 对热敏感,5630min可灭活；最适pH为7.08.0，3.0和10.0感染力很快被破坏；对紫外线敏感；对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感。 62024/7/29流行性感冒概述流行性感冒（简称流感）流行性感冒（简称流感）： 是由甲（是由
5、甲（A A）、乙（）、乙（B B）、丙（）、丙（C C）三型流感病毒分别）三型流感病毒分别 引起的急性呼吸道传染病。引起的急性呼吸道传染病。临床表现临床表现： 起病急、高热（起病急、高热（38384040）、肌痛、头痛伴有严重不）、肌痛、头痛伴有严重不适、干咳、咽喉痛或鼻炎，多数患者可在一到两周内恢适、干咳、咽喉痛或鼻炎，多数患者可在一到两周内恢复。复。 潜伏期短（潜伏期短（1 -1 - 3 3天）、经呼吸道飞沫传播，传播迅天）、经呼吸道飞沫传播，传播迅速，抗原易变异，人群对变异株普遍易感，控制难度大，速，抗原易变异，人群对变异株普遍易感，控制难度大，流感流行呈一定季节性。流感流行呈一定季节性
6、。72024/7/29流感病毒概述分型与命名分型与命名 根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群。毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群。 根据病毒粒核蛋白（根据病毒粒核蛋白（NPNP）和膜蛋白（）和膜蛋白（MP)MP)抗原特性及其抗原特性及其基因特性的不同，基因特性的不同，可以将病毒分为甲（可以将病毒分为甲（A A）、乙（）、乙（B B）、丙）、丙（C C）三型。）三型。 甲型流感病毒根据其表面结构（甲型流感病毒根据其表面结构（H H和和N N）及其基因特性的）及其基因特性的不同可分
7、为多种亚型。不同可分为多种亚型。 82024/7/29目前已从甲型流感病毒的天然宿主水禽中分离到16种HA与9种NA亚型的甲型流感病毒。92020/3/15禽流感病毒禽流感病毒H5N1H5N1、H9N2H9N2、H7N7H7N7以及以及H10N7H10N7等均有感染人的报等均有感染人的报道。道。血清学的证据表明血清学的证据表明H4H4、 H6H6以及以及H11H11亚型亚型 AIVsAIVs也可能感染过也可能感染过人。人。根据禽流感病毒对鸡致病性的不同，根据禽流感病毒对鸡致病性的不同，AIVsAIVs可以分为低致病可以分为低致病性禽流感病毒（性禽流感病毒（LPAIVLPAIV）和高致病性禽流感
8、病毒（）和高致病性禽流感病毒（HPAIVHPAIV）。）。近几十年，不断有近几十年，不断有HPAIVHPAIV和和LPAIVLPAIV感染人的报道，均是由禽感染人的报道，均是由禽直接传给了人，并没有病毒能在人群中有效传播的证据。直接传给了人，并没有病毒能在人群中有效传播的证据。H7H7亚型亚型AIVsAIVs也可按照地域不同分为两个基因谱系：北美谱也可按照地域不同分为两个基因谱系：北美谱系和欧亚谱系，且均有感染人的报道系和欧亚谱系，且均有感染人的报道102024/7/29副粘病毒的基本特征副粘病毒的基本特征l副粘病毒科副粘病毒科(Paramyxoviridae)拥有拥有2个病毒亚科个病毒亚科6
9、个属。个属。l副副粘粘病病毒毒的的基基因因组组为为单单股股负负链链RNA，不不分分节节段段。基基因因组组约约1520kb，编码的蛋白，编码的蛋白811个或更多。个或更多。l副副粘粘病病毒毒毒毒粒粒直直径径约约150350nm，含含有有螺螺旋旋状状核核壳壳。病病毒毒颗颗粒粒呈呈多多形形性性，但但通通常常为为圆圆形形，均均有有包包膜膜。即即使使在在同同一种病毒，毒粒的大小也不相同。细胞浆内复制。一种病毒，毒粒的大小也不相同。细胞浆内复制。112024/7/29122024/7/29小小RNA病毒的基本特征病毒的基本特征l小小RNA病病毒毒(Picornavirus) 小小RNA病病毒毒有有9个个属
10、属，其其中中已已知知5个个含含有有人人类类病病原原。小小RNA病病毒毒颗颗粒粒每每个个含含有有4种种蛋蛋白白（VP1-VP4），各各有有60个个拷拷贝贝，呈呈二二十十面面体体对对称称结结构构，直径大约直径大约30nm，无包膜。，无包膜。l小小RNA病病毒毒基基因因组组为为单单股股正正链链RNA分分子子，大大小小约约8kb，能能够够在在细细胞胞浆浆内内翻翻译译出出病病毒毒复复制制所所需需的的所所有有病病毒毒蛋蛋白白，因此具有感染性。因此具有感染性。132024/7/29Cox肠道病毒肠道病毒感染特点感染特点感染特点感染特点l非非脊脊髓髓灰灰质质炎炎肠肠道道病病毒毒（NPEV），主主要要包包括括C
11、ox、ECHO和一些新型肠道病毒；和一些新型肠道病毒；l感感染染广广泛泛，仅仅在在美美国国每每年年症症状状性性感感染染达达500万万1000万万。感感染染主主要要发发生生在在夏夏秋秋季季节节，发发病病率率和和严严重重程程度度与与年年龄龄成成反反比，幼儿是主要受害者；比，幼儿是主要受害者；l可可引引起起普普通通感感冒冒、心心肌肌炎炎、无无菌菌性性脑脑膜膜炎炎、脑脑炎炎等等多多种种疾疾病。绝大部分感染是无症状性的，很难与鼻病毒感染区分。病。绝大部分感染是无症状性的，很难与鼻病毒感染区分。142024/7/29l在液体中稳定；在液体中稳定；l脑脑脊脊液液、血血清清、全全血血、尿尿可可以以放放在在原原
12、始始采采集集管管中中送送交交实实验室；直肠或咽拭子、鼻洗液等放入验室；直肠或咽拭子、鼻洗液等放入VTM；样本采集样本采集样本采集样本采集肠道病毒肠道病毒152024/7/29鼻病毒鼻病毒l病病毒毒复复制制及及症症状状特特征征主主要要在在鼻鼻部部，人人普普通通感感冒冒有有1/31/2由由鼻鼻病病毒毒引引起；起；l1960年年代代分分离离成成功功，至至1987年年已已经经鉴鉴别别了了100血血清清型型；根根据据基基因因特特征征可将这些血清型分为可将这些血清型分为A、B两属；两属；2007年发现年发现C属，目前不能培养属，目前不能培养l温温带带地地区区感感染染高高峰峰为为每每年年9月月，春春天天有有
13、第第二二次次感感人人那那高高峰峰，夏夏天天可可持持续发生；续发生；l无组特异性抗原，型见可有交叉，血清型变化频繁；无组特异性抗原，型见可有交叉，血清型变化频繁；l病毒经呼吸道分泌物从人传播到人；病毒经呼吸道分泌物从人传播到人；l潜潜伏伏期期23d, 病病毒毒排排出出高高峰峰期期与与急急性性鼻鼻炎炎一一致致；45d时时检检测测不不到到病病毒或维持低滴度达毒或维持低滴度达2周，症状一般维持周，症状一般维持7d;l下下呼呼吸吸道道感感染染也也常常发发生生。尤尤其其是是对对于于婴婴幼幼儿儿、老老年年人人、慢慢性性病病患患者者或或原有肺病患者，常与原有肺病患者，常与RSV感染不易区分；感染不易区分；l没
14、有胞膜，对有机溶剂有抵抗力。没有胞膜，对有机溶剂有抵抗力。感染特点感染特点感染特点感染特点162024/7/29l症状出现后症状出现后16d均可分离到病毒，病毒排泌均可分离到病毒，病毒排泌13 d明显；明显；l标本应在鼻部采集而不是咽部采集；标本应在鼻部采集而不是咽部采集；l鼻洗液是鼻病毒分离最好的标本；样本鼻洗液是鼻病毒分离最好的标本；样本4可保存可保存2448h。鼻病毒鼻病毒样本采集样本采集样本采集样本采集172024/7/29l线型双链线型双链DNA，不分节不分节段，基因段，基因组长组长3000042000bp，编码约编码约30种种蛋白；蛋白；l病毒无包膜，二十面立体对称，直径约病毒无包
15、膜，二十面立体对称，直径约7090nm，具，具12个顶角和纤维个顶角和纤维刺突。刺突。腺病毒腺病毒182024/7/29l潜伏期潜伏期58d；l通常为局部感染；通常为局部感染；l约约5%的的儿儿童童急急性性呼呼吸吸道道疾疾病病及及约约10%的的婴婴幼幼儿儿腹腹泻泻由由腺腺病病毒毒引起；引起；l咽咽炎炎，急急性性呼呼吸吸系系统统疾疾病病（3，4，7，21，1，2，5，6），滤滤泡泡性性结结膜膜炎炎，流流行行性性角角膜膜结结膜膜炎炎，咽咽结结膜膜热热，尿尿路路感感染染（子子宫宫颈炎、尿道炎、出血性膀胱炎）以及无颈炎、尿道炎、出血性膀胱炎）以及无症状持续感染；症状持续感染；l脑膜脑炎脑膜脑炎可为腺病
16、毒呼吸道感染的并发症可为腺病毒呼吸道感染的并发症。腺病毒腺病毒感染特点感染特点感染特点感染特点192024/7/29202024/7/29212024/7/29l鼻鼻咽咽拭拭子子或或抽抽出出物物、鼻鼻拭拭子子或或抽抽出出物物、眼眼分分泌泌物物拭拭子子、粪粪便便或或直直肠肠拭拭子子、尿尿、尿尿道道或或宫宫颈颈拭拭子子以以及及活活检检或或尸尸检检组组织织都是可根据病人症状获得的合适标本。都是可根据病人症状获得的合适标本。l疾疾病病早早期期正正确确收收集集样样品品并并立立即即冷冷冻冻送送往往实实验验室室可可大大大大提提高高病毒检出率。病毒检出率。l用用血血清清学学方方法法建建立立或或证证实实诊诊断断
17、需需要要配配对对的的血血样样。第第一一份份样样品在症状出现后应立即尽快收集，第二份应在品在症状出现后应立即尽快收集，第二份应在2-4周后收集周后收集。样本采集样本采集样本采集样本采集腺病毒腺病毒222024/7/29冠冠状状病毒病毒l单股正链单股正链RNA，27-31KD,5端甲基化端甲基化“帽子帽子”，3端端polyA尾。尾。l 根据基因序列和血清学，分成三组，感染人类的分属于根据基因序列和血清学，分成三组，感染人类的分属于I和和II组，包括组，包括229E、NL63、OC43、HKU1和和SARS-CoV。Woo,etal.ExpBiolMed.2009,234:1117112723202
18、0/3/15l可引起呼吸道、肠道感染，也可能引起神经可引起呼吸道、肠道感染，也可能引起神经症状。症状。l非非SARS-CoV病病毒毒，通通过过呼呼吸吸道道飞飞沫沫传传播播，尚尚无无动动物物模模型，多数感染较轻，为自限型，多数感染较轻，为自限性，性，可加重可加重慢阻肺等疾病。慢阻肺等疾病。l分分布布广广泛泛，主主要要发发生生在在冬冬季季和和早早春春，美美国国数数据据表表明明，占占成人上呼吸道感染的成人上呼吸道感染的1024% 。l病毒分离可用人胚肾细胞或病毒分离可用人胚肾细胞或器官培养。器官培养。冠状病毒冠状病毒感染特点感染特点感染特点感染特点242024/7/29呼吸道病毒标本采集、运输、保存
19、呼吸道病毒标本采集、运输、保存252024/7/29流感样病例定义是指发热（体温大于等于38），伴咳嗽或咽痛之一者。262024/7/29不明原因肺炎病例定义同时具备以下4条,不能明确诊断为其它疾病的肺炎病例:(1)发热(腋下体温38);(2)具有肺炎的影像学特征;(3)发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计数减少;(4)经规范抗菌药物治疗3-5天，病情无明显改善或呈进行性加重。272024/7/29呼吸道症候群病例定义（一）急性感染表现（至少符合下列的一项）：（一）急性感染表现（至少符合下列的一项）：发热（从发病开始有报告和记录）发热（从发病开始有报告和记录），WBC升高或降低，或升
20、高或降低，或WBC分布分布异常异常，寒战寒战，体温降低（考虑年龄）体温降低（考虑年龄）（二）呼吸道临床表现（至少符合下列的一项）：（二）呼吸道临床表现（至少符合下列的一项）：咽部不适、咽干或咽痛咽部不适、咽干或咽痛，鼻塞、流涕鼻塞、流涕，鼻鼻/咽咽/喉明显充血、水肿喉明显充血、水肿，咳嗽咳嗽（新发或咳嗽加重）（新发或咳嗽加重），咳痰咳痰，气短气短，听诊呼吸音异常（湿啰音，干啰音，听诊呼吸音异常（湿啰音，干啰音，哮鸣音，浊音）哮鸣音，浊音），胸痛胸痛其中肺炎病例其中肺炎病例具有上述具有上述(一一)和和(二二),并具备并具备-（三）肺炎症状：（三）肺炎症状：胸部胸部X线片提示肺部炎性改变线片提示肺
21、部炎性改变注注:从肺炎病例采集的标本数比例不少于所承担发热呼吸道症候群总任从肺炎病例采集的标本数比例不少于所承担发热呼吸道症候群总任务量的务量的20%。282024/7/29针对各种标本的病毒与细菌检测项目的流程图如下针对各种标本的病毒与细菌检测项目的流程图如下： 病病例例标标本本采采集集全血全血鼻鼻/ /咽拭子咽拭子尿液尿液鼻咽抽吸物鼻咽抽吸物支气管肺泡灌洗液支气管肺泡灌洗液细菌培养和鉴定细菌培养和鉴定急性期急性期/ /恢复期血清恢复期血清可可疑疑病病毒毒抗抗体体检检测测（备备选选项项）、肺肺炎炎支支原体和肺炎衣原体抗体检测（备选项）原体和肺炎衣原体抗体检测（备选项）病病毒毒核核酸酸检检测测
22、（阳阳性性者者部部分分继继续续进进行行病病毒毒分分离离）、肺肺炎炎支支原原体体和和肺肺炎炎衣衣原原体体DNADNA检测检测嗜肺军团菌、肺炎链球菌快速抗原检测嗜肺军团菌、肺炎链球菌快速抗原检测痰液痰液肺肺炎炎支支原原体体及及肺肺炎炎衣衣原原体体DNADNA检检测测；细细菌菌培培养养和和鉴鉴定定（鼻鼻咽咽抽抽吸吸物物和和支支气气管管肺肺泡泡灌灌洗洗液液阴阴性性者者进进行行细细菌菌DNADNA检检测测）；病病毒毒核核酸酸检检测测（阳阳性性者者部部分分继继续续进进行行病毒分离）病毒分离）胸腔穿刺液胸腔穿刺液292024/7/29相关法律法规相关法律法规依据中华人民共和国传染病防治法开展标本的采集和检测
23、。标本的采集和检测应严格遵守病原微生物实验室生物安全管理条例(国务院424号令2004年11月12日起实施)，并严格做好个人防护标本的保存与运输严格遵守可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部45号令2006年2月1日起施行）具体依据人间传染的病原微生物名录（卫科教发200615号2006年1月11日发布）302024/7/29病原微生物标本的采集条件病原微生物标本的采集条件具有与采集病原微生物样本所需要的生物安全具有与采集病原微生物样本所需要的生物安全具有与采集病原微生物样本所需要的生物安全具有与采集病原微生物样本所需要的生物安全防护水平相适应的设备，包括个人防护用
24、品（隔防护水平相适应的设备，包括个人防护用品（隔防护水平相适应的设备，包括个人防护用品（隔防护水平相适应的设备，包括个人防护用品（隔离衣、帽、口罩、鞋套、手套、防护眼镜等）、离衣、帽、口罩、鞋套、手套、防护眼镜等）、离衣、帽、口罩、鞋套、手套、防护眼镜等）、离衣、帽、口罩、鞋套、手套、防护眼镜等）、防护材料、器材和防护设施等防护材料、器材和防护设施等防护材料、器材和防护设施等防护材料、器材和防护设施等具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员具有有效的防止病原微生物扩散和感染的
25、措施具有有效的防止病原微生物扩散和感染的措施具有有效的防止病原微生物扩散和感染的措施具有有效的防止病原微生物扩散和感染的措施具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手段段段段 采集过程中应对标本的来源、采集过程和方法采集过程中应对标本的来源、采集过程和方法采集过程中应对标本的来源、采集过程和方法采集过程中应对标本的来源、采集过程和方法等作详细记录。等作详细记录。等作详细记录。等作详细记录。312024/7/29病原病原微生物标本采集原则微生物标本采集原则 早、快、近（病变部位）
26、、多、净早、快、近（病变部位）、多、净早、快、近（病变部位）、多、净早、快、近（病变部位）、多、净应根据病例的临床表现应根据病例的临床表现采集不同时期、不同种类的标本采集不同时期、不同种类的标本 死亡病例死亡病例最好采集尸检标本最好采集尸检标本，并尽可能地收集医院已检，并尽可能地收集医院已检的临床标本的临床标本 没有条件进行尸体解剖的，可根据检测目的采集呼吸道没有条件进行尸体解剖的，可根据检测目的采集呼吸道灌洗液、肛拭子或经皮穿刺采集胸水、腹水、肺组织标灌洗液、肛拭子或经皮穿刺采集胸水、腹水、肺组织标本等本等322024/7/29病原微生物标本的种类病原微生物标本的种类 呼吸道样品：呼吸道样品
27、：呼吸道样品：呼吸道样品：上呼吸道样品：咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻洗液、上呼吸道样品：咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻洗液、上呼吸道样品：咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻洗液、上呼吸道样品：咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻洗液、咽漱液、深咳痰液、鼻咽抽取物。咽漱液、深咳痰液、鼻咽抽取物。咽漱液、深咳痰液、鼻咽抽取物。咽漱液、深咳痰液、鼻咽抽取物。最佳采集时间为发病最佳采集时间为发病后后3 3天内，一般不超过天内，一般不超过7 7天。天。下呼吸道样品：呼吸道抽取物、呼吸道灌洗液、胸水、下呼吸道样品：呼吸道抽取物、呼吸道灌洗液、胸水、下呼吸道样品：呼吸道抽取物、呼吸道灌洗液、胸水、下呼吸道样品：呼吸道抽取物
28、、呼吸道灌洗液、胸水、肺组织标本。肺组织标本。肺组织标本。肺组织标本。下呼吸道标本最有利于病毒分离。下呼吸道标本最有利于病毒分离。 消化道样品：粪便、肛拭子、胃内容物。消化道样品：粪便、肛拭子、胃内容物。消化道样品：粪便、肛拭子、胃内容物。消化道样品：粪便、肛拭子、胃内容物。 其他样品：血液、脑脊液、尿液、疱疹液、瘀斑或出血其他样品：血液、脑脊液、尿液、疱疹液、瘀斑或出血其他样品：血液、脑脊液、尿液、疱疹液、瘀斑或出血其他样品：血液、脑脊液、尿液、疱疹液、瘀斑或出血点、皮肤溃疡分泌液、体液标本、脓或伤口标本、尸检点、皮肤溃疡分泌液、体液标本、脓或伤口标本、尸检点、皮肤溃疡分泌液、体液标本、脓或
29、伤口标本、尸检点、皮肤溃疡分泌液、体液标本、脓或伤口标本、尸检标本。标本。标本。标本。332024/7/29标本采集的器材和容器标本采集的器材和容器标本采集的器材和容器应是无菌的，在有效期内使用。标本采集的器材和容器应是无菌的，在有效期内使用。标本标本容器最好使用可耐深低温的塑料制品。如外螺旋盖容器最好使用可耐深低温的塑料制品。如外螺旋盖容器最好使用可耐深低温的塑料制品。如外螺旋盖容器最好使用可耐深低温的塑料制品。如外螺旋盖带密封垫圈的无菌螺口塑料管或瓶。带密封垫圈的无菌螺口塑料管或瓶。带密封垫圈的无菌螺口塑料管或瓶。带密封垫圈的无菌螺口塑料管或瓶。 采集好的标本应规范标识独立包装在带密封条的
30、塑料袋采集好的标本应规范标识独立包装在带密封条的塑料袋采集好的标本应规范标识独立包装在带密封条的塑料袋采集好的标本应规范标识独立包装在带密封条的塑料袋中。中。中。中。342024/7/29标本容器标本容器352024/7/29采咽拭子的器材和容器采咽拭子的器材和容器362024/7/29采鼻拭子的器材和容器采鼻拭子的器材和容器372024/7/29采集血标本的器材和容器采集血标本的器材和容器382024/7/29BDSST血清分离胶管血清分离胶管BDSST管内壁均匀管内壁均匀喷涂促凝涂促凝剂加速血液凝固，加速血液凝固，缩短周短周转时间（TAT）。惰性分离胶用于离心后分隔血）。惰性分离胶用于离心
31、后分隔血细胞和血清，可提高血清胞和血清，可提高血清产量，量，较长时间保持血清保持血清成分的成分的稳定，利于定，利于样本的复本的复检。分离胶。分离胶稳定性定性强，不易吸附血清中的蛋白，不易吸附血清中的蛋白质，对药物物检测及普通的生化及普通的生化检测可得出真可得出真实的的结果。果。BDPST血血浆分离胶管分离胶管BDPST管内含有惰性分离胶，可分隔血管内含有惰性分离胶，可分隔血细胞和血胞和血浆，提高血，提高血浆产量，保持血量，保持血浆成分的成分的稳定。用于采集血定。用于采集血浆样本，消除凝血本，消除凝血时间，缩短周短周转时间(TAT)。通常用于重症通常用于重症监护和急和急诊检测。BD血清管血清管B
32、D血清管用于采集静脉血后分离出血清，血清管用于采集静脉血后分离出血清，应用于用于临床化学、血清学、免疫学、治床化学、血清学、免疫学、治疗药物物监测、微量元素、微量元素测定定。促凝。促凝剂的作用是加速血液凝固。采用促凝的作用是加速血液凝固。采用促凝管可以管可以缩短周短周转时间。BD血血浆管管BD血血浆管用于采集静脉血后分离出血管用于采集静脉血后分离出血浆，应用于用于临床生化等床生化等检验。血。血浆管内壁均匀管内壁均匀喷涂肝素涂肝素锂或肝素或肝素钠用于血液抗凝，适于大多数用于血液抗凝，适于大多数临床生化床生化检测，可以，可以作作为那些不用分离胶管而又需要血那些不用分离胶管而又需要血浆标本的本的实验
33、室的主要采血管。室的主要采血管。BD血糖管血糖管BD血糖管用于血糖血糖管用于血糖测定或糖耐量定或糖耐量检测，管壁均匀，管壁均匀喷涂抗凝涂抗凝剂（草酸（草酸钾）及糖原）及糖原稳定定剂（氟化（氟化钠），糖原），糖原稳定定剂可以使血糖可以使血糖浓度在室温条件下保持度在室温条件下保持24小小时稳定。定。BDEDTA血常血常规管管血常血常规管含有管含有EDTA的二的二钾盐或三或三钾盐，其中二，其中二钾盐呈呈雾状均匀状均匀喷涂于管壁。涂于管壁。该管主要用于血管主要用于血细胞学胞学检测如血象，血如血象，血红蛋白，糖化血蛋白，糖化血红蛋白，蛋白，环胞素，胞素，红细胞叶酸及胞叶酸及输血前血前检测（血型、抗体（血
34、型、抗体筛查、交叉配型）。、交叉配型）。BD血凝管血凝管BD血凝管主要用于凝血四血凝管主要用于凝血四项检测（凝血（凝血酶原原时间、凝血、凝血酶时间、活化部分凝血活、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原），指蛋白原），指导临床如口服床如口服华法林治法林治疗的的监控、静脉控、静脉输注注肝素治肝素治疗的的监控以及控以及“特殊凝血研究特殊凝血研究”（凝血因子（凝血因子检测、如第、如第VIII因子或血友病因子、血小板功能因子或血友病因子、血小板功能检测）。）。BDVacutainer血沉管（血沉管（ESR管）管）血沉管用于血沉管用于红细胞沉降率的胞沉降率的测定，含有定，含有3.2%枸枸橼酸酸钠溶液抗凝，抗凝
35、溶液抗凝，抗凝剂与血液的比例与血液的比例为1:4。玻璃管可配合血沉架或全自。玻璃管可配合血沉架或全自动血沉血沉仪联合使用，合使用，该方法方法为封封闭系系统，无需打开管帽，采血后直接操作。，无需打开管帽，采血后直接操作。-BDPAXgeneTM全血全血RNA管管能能稳定血定血细胞内的胞内的RNA水平，延水平，延长血液血液标本体外放置的本体外放置的时间，利于批量采集，利于批量采集，细胞胞转录水平保真性好可用于与血水平保真性好可用于与血细胞胞RNA相关的相关的RT-PCR检测，人，人类疾疾病基因病基因转录谱的研究及其他的研究及其他RNA转录相关的相关的检测392024/7/29标本采集方法标本采集方
36、法 咽拭子：咽拭子：用用2 2根聚丙根聚丙烯纤维头的塑料杆拭烯纤维头的塑料杆拭子同时檫拭双侧咽扁子同时檫拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭桃体及咽后壁，将拭子头浸入含子头浸入含3 3mlml采样液采样液的管中，弃去尾部，的管中，弃去尾部，旋紧管盖。旋紧管盖。402024/7/29标本采集方法标本采集方法 鼻拭子：鼻拭子：将将1 1根聚丙烯根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出；取片刻后缓慢转动退出；取另另1 1根聚丙烯纤维头的塑根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔；将上述集另一侧鼻孔；将
37、上述2 2根拭子浸入同一含根拭子浸入同一含3 3mlml采采样液的管中，弃去尾部，样液的管中，弃去尾部，旋紧管盖。旋紧管盖。412024/7/29标本采集方法标本采集方法鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。取呼吸道分泌物。先将收集先将收集器头部插入鼻腔或气管，接器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并通负压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，缓慢退出；收集抽取的粘液，并用采样液并用采样液3 3mlml涮洗收集器涮洗收集器1 1次（可用小孩导尿管接在次（
38、可用小孩导尿管接在5050mlml注射器上来代替收集）注射器上来代替收集）422024/7/29吸取过程吸取过程正确错误错误不要触摸病人的脸不要触摸病人的脸!432024/7/29标本采集方法标本采集方法咽漱液：咽漱液：用用1010mlml不含抗菌素的采样液漱口不含抗菌素的采样液漱口（漱时让患者头部微后仰，发（漱时让患者头部微后仰，发“噢噢”声，让洗声，让洗液在咽部转动）液在咽部转动），然后将咽漱液收集于然后将咽漱液收集于5050mlml无无菌的螺口塑料管中。无条件的可用平皿或烧杯菌的螺口塑料管中。无条件的可用平皿或烧杯收集咽漱液并转入收集咽漱液并转入1010mlml螺口采样管中。螺口采样管中
39、。442024/7/29标本采集方法标本采集方法深咳痰液：深咳痰液：肺部感染应采取痰标本，以清晨肺部感染应采取痰标本，以清晨第一口痰为最佳。采集前要求患者用清水漱口第一口痰为最佳。采集前要求患者用清水漱口数次，以除去口腔内的大量杂菌，患者深咳后，数次，以除去口腔内的大量杂菌，患者深咳后，将咳出的痰液收集于含将咳出的痰液收集于含3ml3ml采样液的采样液的50ml50ml无菌无菌螺口采样管中。螺口采样管中。呼吸道灌洗液：呼吸道灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约插口处插入气管（约3030cmcm深处），注入深处），注入5 5mlml生生理盐水，接通负压，旋转
40、收集器头部并缓慢退理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器出；收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1 1次（可用小孩导尿管接在次（可用小孩导尿管接在5050mlml注射器上来代注射器上来代替收集）。替收集）。452024/7/29标本采集方法标本采集方法胸水：胸水：在在B B超定位下进行胸腔穿刺，抽取胸水超定位下进行胸腔穿刺，抽取胸水5 5mlml，置于无置于无菌的塑料螺口管中。菌的塑料螺口管中。肺组织活检标本：肺组织活检标本：在超声或在超声或X X线定位下，经皮穿刺取肺组线定位下，经皮穿刺取肺组织活检标本，置于含织活检标本，置于含3 3mlml采样液的
41、塑料螺口管中。采样液的塑料螺口管中。尸检标本：尸检标本：在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸检，在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸检，根据检测目的可采集肺、肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结根据检测目的可采集肺、肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等组织标本。等组织标本。病人死亡后应依法尽早进行解剖，无菌采集，病人死亡后应依法尽早进行解剖，无菌采集，每一采集部位分别使用不同消毒器械，以防交叉污染；每每一采集部位分别使用不同消毒器械，以防交叉污染；每组织应多部位取材，各组织应取组织应多部位取材，各组织应取20205050g g，淋巴取淋巴取2 2个。个。462024/7/29标本采集方法标本采集方法粪便
42、标本：粪便标本：对黏液脓血便应挑取黏液或脓血部分，对黏液脓血便应挑取黏液或脓血部分，液状粪便采集水样便或含絮状物的液状粪便液状粪便采集水样便或含絮状物的液状粪便2 25ml5ml；成形粪便至少取；成形粪便至少取5g5g粪便置于无菌螺口管中，最好粪便置于无菌螺口管中，最好加有保存液或增菌液。加有保存液或增菌液。肛拭子：肛拭子：若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门湿润过的棉拭子插入肛门4 45cm5cm深处（小儿深处（小儿2 23cm3cm）轻轻转动一圈，取直肠表面的黏液后取出，）轻轻转动一圈，取直肠表面的黏液后取出，用于病毒检测的肛拭子立
43、即放入含用于病毒检测的肛拭子立即放入含3ml3ml病毒保存液病毒保存液的带外螺旋盖的试管中，用于细菌检测的肛拭子需的带外螺旋盖的试管中，用于细菌检测的肛拭子需将样品接种到增菌液中，或将标本插入将样品接种到增菌液中，或将标本插入Cary-Blair Cary-Blair 运送半固体培养基中，但不得冷冻。运送半固体培养基中，但不得冷冻。 472024/7/29标本采集方法标本采集方法血清标本：血清标本：用真空负压采血管采集血液标本用真空负压采血管采集血液标本5 5mlml，室温静置室温静置3030分钟，分钟，1500150020002000rpmrpm离心离心1010分钟，收分钟，收集血清于集血清
44、于2 2mlml无菌螺口塑料管中。无菌螺口塑料管中。每一例病人须采每一例病人须采集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早（最好在发病后（最好在发病后7 7天内）采集，第二份血清应在发天内）采集，第二份血清应在发病后第病后第3 34 4周采集。以空腹血为佳。周采集。以空腹血为佳。病例诊断需病例诊断需双份血清。双份血清。全血：全血：用一次性真空抗凝采血管采集病人用一次性真空抗凝采血管采集病人5ml5ml静脉静脉血，立即缓慢地颠倒采血管血，立即缓慢地颠倒采血管3-53-5次，次，44条件下立条件下立即送至有关实验室。即送至有关实验室。482024/7/29
45、不同疾病标本的采集不同疾病标本的采集流行性感冒：流行性感冒：采发病采发病3 3天内流感样病例（天内流感样病例（T38T38、伴、伴有咽痛或咳嗽症状之一者有咽痛或咳嗽症状之一者, ,缺乏其它实验室确定诊断依据缺乏其它实验室确定诊断依据 ）的咽拭子或鼻咽拭子放入）的咽拭子或鼻咽拭子放入3-5 ml3-5 ml采样液中或采集病人采样液中或采集病人的含漱液的含漱液10 ml 10 ml ，冷藏运送至实验室。，冷藏运送至实验室。最好没有服用过最好没有服用过抗病毒药物。抗病毒药物。 麻疹：麻疹：作病毒分离的样品，要在前驱期或出疹初期（作病毒分离的样品，要在前驱期或出疹初期（ T38T38、3 3天内）采病
46、人的咽拭子放入天内）采病人的咽拭子放入3-5 ml3-5 ml采样液中采样液中冷藏送至实验室；作血清学诊断的样品，则在出疹后冷藏送至实验室；作血清学诊断的样品，则在出疹后- -天采集静脉血，必要时间隔天采集静脉血，必要时间隔1 1周再采周再采1 1次。次。 492024/7/29不同疾病标本的采集不同疾病标本的采集SARSSARS/ /人人禽流感禽流感/MERS/MERS：应在发病不同时期分别采集住院应在发病不同时期分别采集住院病人的不同标本，早期可采集病人的咽拭子、鼻拭子、病人的不同标本，早期可采集病人的咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液等上呼吸道标本；病人鼻咽抽取物、咽漱液、深咳
47、痰液等上呼吸道标本；病人上呼吸机后，可采集呼吸道抽取物、支气管灌洗液等下上呼吸机后，可采集呼吸道抽取物、支气管灌洗液等下呼吸道标本；如果病例有腹泻症状，可采集粪便标本；呼吸道标本；如果病例有腹泻症状，可采集粪便标本；有胸水者可采集胸水标本；须采集急性期、恢复期双份有胸水者可采集胸水标本；须采集急性期、恢复期双份血清；必要时还可采集全血。血清；必要时还可采集全血。 502024/7/29标本的采集（一）注意事项（一）注意事项确认符合病例定义后尽早采集（尽量在采取治疗措施前）确认符合病例定义后尽早采集（尽量在采取治疗措施前）采集时严格无菌操作，减少或避免机体正常菌群及其它杂菌污染采集时严格无菌操作
48、，减少或避免机体正常菌群及其它杂菌污染采集后应尽快送检。床旁接种可提高病原菌检出率。采集后应尽快送检。床旁接种可提高病原菌检出率。 送检标本应贴条形码，并附送检单，送检单上应注明姓名、送检标本应贴条形码，并附送检单，送检单上应注明姓名、( (编号编号) )、标本来源、检验目的和标本采集具体时间。、标本来源、检验目的和标本采集具体时间。填写病例信息调查表。填写病例信息调查表。严格按生物安全规范操作。严格按生物安全规范操作。512024/7/29（二）（二）各种标本的采集各种标本的采集要求要求病毒检测：（检测一类标本即可）病毒检测：（检测一类标本即可）鼻鼻/咽拭子（必采项）咽拭子（必采项）痰液（尽
49、量采集）痰液（尽量采集）鼻咽抽吸物（尽量采集）鼻咽抽吸物（尽量采集）胸腔穿刺液（尽量采集）胸腔穿刺液（尽量采集）支气管肺泡灌洗液（尽量采集）支气管肺泡灌洗液（尽量采集）血液（尽量采集）血液（尽量采集）细菌检测：细菌检测：血液（必采项）血液（必采项）痰液（必采项）痰液（必采项）胸腔穿刺液（尽量采集）胸腔穿刺液（尽量采集）支气管肺泡灌洗液（尽量采集）支气管肺泡灌洗液（尽量采集）尿液：军团菌、肺炎链球菌快速抗原检测（必采项）尿液：军团菌、肺炎链球菌快速抗原检测（必采项）522024/7/29联合国对感染性物质的运输分类联合国对感染性物质的运输分类根根据据其其所所运运输输病病原原体体的的传传染染性性和
50、和感感染染后后对对个个体体或或群体的危害程度不同，分为群体的危害程度不同，分为A A类和类和B B类。类。A A类类指指人人感感染染后后发发病病的的可可能能性性大大，传传染染性性强强，对对人人群群危危害害性性大大的的烈烈性性感感染染性性物物质质。高高度度怀怀疑疑具具有有严重危害性的感染性物质也属于严重危害性的感染性物质也属于A A类。类。A A类类之之外外，仅仅具具有有一一般般危危险险性性，引引起起感感染染的的机机会会较少的感染性物质感染性物质为较少的感染性物质感染性物质为B B类类532024/7/29感染性物质运输的包装系统感染性物质运输的包装系统感染性及潜在感染性物质的运输应使用感染性及
51、潜在感染性物质的运输应使用三层包三层包装系统：装系统：内层容器、中层包装、外层包装内层容器、中层包装、外层包装将样品采用防水、防漏的内层容器包装并贴上将样品采用防水、防漏的内层容器包装并贴上指示内容物的标签后装入中层容器指示内容物的标签后装入中层容器内层容器和中层容器间应放置足量的吸水性材内层容器和中层容器间应放置足量的吸水性材料，以便内层容器打破或泄漏时能吸收溢出的所料，以便内层容器打破或泄漏时能吸收溢出的所有液体。有液体。然后将中层容器固定在硬质外层容器中以免中然后将中层容器固定在硬质外层容器中以免中层容器在运输过程中受到物理性损坏。层容器在运输过程中受到物理性损坏。 542024/7/2
52、9标本的包装A类包装，符合UN2814要求容器或包装材料应达到国际民航组织危险物品航空安全运输技术细则（Doc9284包装说明PI602）规定的A类包装标准552024/7/29标本的包装三层包装第一层为离心管第二层为防水、防漏的安全壳容器第三层为运输包装包装要求样本应用吸水纸等包裹，固定在自封袋或离心管内在坚固、防水、防漏的第二层安全壳容器中，用吸水纸等填充物将内有标本的自封袋或离心管固定好，装入第三层包装第二层和第三次包装之间应放置冰排等制冷材料安全壳容器和外包装须与IATA危险物品条例包装制度650相符合562024/7/29标本的运送血液标本、鼻血液标本、鼻/ /咽拭子、痰液、鼻咽抽吸
53、物、支气管肺泡灌咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物、支气管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液、尿液标本采集后应该尽快送检。洗液、胸腔穿刺液、尿液标本采集后应该尽快送检。血培养瓶须在血培养瓶须在2424小时内送检，送检前置于常温环境（小时内送检，送检前置于常温环境（15-15-3030）保存。）保存。其他标本送检前应保存在其他标本送检前应保存在4-84-8，如，如2424小时内无法检测的标小时内无法检测的标本则应置于本则应置于-70-70或以下保存，但应避免反复冻融。或以下保存，但应避免反复冻融。标本运送过程中，血培养瓶应置于标本运送过程中，血培养瓶应置于15-3015-30环境中环境中, ,其他标其他标本应置本应置
54、4-84-8运送。运送。 572024/7/29收取标本由医院所在地的疾病预防控制机构到医院收取标本。标本运输之前，应按相关生物安全规定，与样本接收单位生物安全管理部门联系，办理相关手续运送日期确定后，立即将运送时间和运输方式通知接收单位，做好接收准备582024/7/29标本的保存（一）检测标本的存放（一）检测标本的存放l血清、呼吸道标本、尿液标本、胸腔穿刺液标本抵达检测实验室后，原血清、呼吸道标本、尿液标本、胸腔穿刺液标本抵达检测实验室后，原则上应尽早进行病毒和细菌检测；则上应尽早进行病毒和细菌检测；l进行病毒检测的标本，进行病毒检测的标本，24小时内能进行检测的可置于小时内能进行检测的可
55、置于4保存，保存，24小时小时内不能进行检测的则应置于内不能进行检测的则应置于-70或以下保存；或以下保存；l用于细菌培养的标本，应立即分离，不应存放后分离。标本应避免反复用于细菌培养的标本，应立即分离，不应存放后分离。标本应避免反复冻融。冻融。（二）标本的长期保存（二）标本的长期保存所采标本抵达实验室后，血清、呼吸道标本、尿液标本、胸腔穿刺液所采标本抵达实验室后，血清、呼吸道标本、尿液标本、胸腔穿刺液标本按需要分装成所需份数，置标本按需要分装成所需份数，置-70-70冰箱或以下保存。冰箱或以下保存。 592024/7/29（二）标本的处理（一）呼吸道标本（一）呼吸道标本用于病毒检测前需进行分
56、装用于病毒检测前需进行分装分装鼻分装鼻/ /咽拭子标本时，注意充分挤压拭子头，保证咽拭子标本时，注意充分挤压拭子头，保证细胞充分脱落细胞充分脱落分装管中用于核酸检测的标本，如粘液成分较重，分装管中用于核酸检测的标本，如粘液成分较重，可进行液化等处理可进行液化等处理（二）血清标本（二）血清标本从血标本中分离血清，分装后按方案要求储存从血标本中分离血清，分装后按方案要求储存 602024/7/29呼吸道病原谱（1）流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒和鼻病毒8种病毒以及肺炎支原体和肺炎衣原体的核酸检测。进行细菌培养和鉴定，培养的重点是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌
57、、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、A组乙型链球菌、流感嗜血杆菌。612024/7/29呼吸道病原谱（2）对所有细菌分离培养阴性的胸腔穿刺液和支气管肺泡灌洗液，进行针对所检测细菌和肺炎支原体、肺炎衣原体的核酸检测。对全部尿标本进行肺炎链球菌和嗜肺军团菌的快速抗原检测。凡从无菌部位（全血、支气管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液）采集标本证实一种病原体感染，即可视为检测终点，不要求继续进行其它病原体检测。622024/7/29（三）检测程序检测病毒：检测病毒：人流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人副流感病人流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人副流感病毒、人偏肺病毒、人冠状病毒、人博卡病毒、毒、人偏肺病毒、人冠
58、状病毒、人博卡病毒、人鼻病毒人鼻病毒检测方法：检测方法：核酸核酸PCRPCR检测检测/ /Real-time PCRReal-time PCR（逐步完善）（逐步完善） 分离培养和免疫荧光分离培养和免疫荧光/ /PCRPCR鉴定鉴定血清学检测：各实验室视情况和条件选择实施。血清学检测：各实验室视情况和条件选择实施。632024/7/29呼吸道病毒的核酸检测1. 1. 核酸的提取：核酸的提取：自动化核酸提取自动化核酸提取商品化的核酸人工提取试剂盒商品化的核酸人工提取试剂盒公认的传统方法：如分子克隆。公认的传统方法：如分子克隆。2. 2. 核酸的检测核酸的检测：RT-PCRRT-PCR，PCRPCR
59、Real-time PCRReal-time PCR3. 3. 结果的确证和记录：结果的确证和记录：胶回收胶回收克隆和测序克隆和测序642024/7/29病毒的分离培养（1）1.1.进行病毒分离的标本选择原则：进行病毒分离的标本选择原则：我国目前尚缺乏或存量较少，且具有较大的研究意义的我国目前尚缺乏或存量较少，且具有较大的研究意义的病毒，包括人偏肺病毒，人冠状病毒病毒，包括人偏肺病毒，人冠状病毒。在常规监测研究时，某种病毒核酸检测阳性比例的异常在常规监测研究时，某种病毒核酸检测阳性比例的异常增高时或非常规的聚集性病例时，从中选择适当数量病增高时或非常规的聚集性病例时，从中选择适当数量病例分离例
60、分离5-105-10株病毒。株病毒。鼓励建立人博卡病毒的细胞培养分离体系。鼓励建立人博卡病毒的细胞培养分离体系。652024/7/292. 2. 分离得到的病毒，应采用核酸检测、免疫荧光分离得到的病毒，应采用核酸检测、免疫荧光等方法鉴定病毒种类。等方法鉴定病毒种类。3. 3. 细胞株：应有明确的生物学背景，来源清楚，细胞株：应有明确的生物学背景，来源清楚，并已排除病原体的污染。并已排除病原体的污染。病毒的分离培养（2）662024/7/29实验室生物安全要求l实验室检测相关活动严格按照人间传染的病原微生物名录的要求，在相应的生物安全级别实验室开展病毒培养在BSL-x实验室动物感染实验在ABSL
61、-x实验室未经培养的感染材料的操作在BSL-x实验室灭活材料的操作在BSL-x实验室l按照病原微生物实验室生物安全管理条例等相关规定要求，做好生物安全工作672024/7/29标本上送要求根据要求，应将阳性和部分阴性标本送省疾控中心、中国控中心进行复核检测实验室检测结果应及时反馈标本送检单位，并尽快上报上级主管部门682024/7/29A类标本运输的生物安全要求由专人专车运送，运送人员须有相关资质，且不得少于两人申请单位对与运送人员进行相关的生物安全培训在运送过程中采取相应的防护措施运输前仔细检查容器，要符合安全要求按照规定进行标本运输前的包装和送达后的开启692024/7/29呼吸道病毒检测
62、实验室结果判读呼吸道病毒检测实验室结果判读702024/7/29核酸检测技术技术的原理的原理PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的DNA片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。特异性：引物序列灵敏度：扩增100万倍1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2535轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍712024/7/29RT-PCR和real-timePCRRT-PCR：即逆转录PCR，扩增
63、的模板为RNA，增加RNADNA过程。Real-time PCR：即实时荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。722024/7/29RT-PCR/Real-timeRT-PCR的基本步骤需要主要设备：高速冷冻离心机，PCR仪或荧光定量PCR仪，电泳仪，水平电泳槽，凝胶电泳成像系统，可调加样枪（10ul，200ul，1000ul）。裂解细胞或病毒释放核酸纯化核酸反应管中加入提取的核酸PCR试剂盒混合反应体系反应管放入PCR仪，自动完成扩增程序反应管中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳电泳拍照结果分析裂解细胞或病毒释放核酸纯化核酸反应管中加入提取的
64、核酸PCR试剂盒混合反应体系反应管放入荧光定量PCR仪，自动完成扩增程序732024/7/29PCR检测结果判读742024/7/29荧光PCR结果判读752024/7/29结果解释阴性样品762024/7/29结果解释试验失败772024/7/29结果解释可疑样品782024/7/29结果解释可疑样品792024/7/29阳性样品扩增曲线802024/7/29病毒分离结果-采用的细胞系MDCK细胞：流感病毒LLCMK2细胞：副流感病毒，偏肺病毒，冠状病毒CoV-OC43Hep-2细胞：腺病毒，RSVHela细胞：腺病毒，RSV，冠状病毒CoV-229E，副流感病毒HEL细胞：冠状病毒CoV-
65、229EBSC-1细胞：冠状病毒CoV-OC43812024/7/29MDCKLLCMK2Hep-2822024/7/29832024/7/29检测流程标本敏感细胞系收获培养2-7天PCR、免疫荧光等方法筛选/检测分型842024/7/29Influenza AInfluenza BScreeningScreening852024/7/29RSVNegative862024/7/29尼基氏小体（Negribody）神经细胞荧光染色照片神经细胞荧光染色照片872024/7/29血凝和血凝和血凝血凝抑制实验结果判断抑制实验结果判断l鸡或火鸡红细胞阳性(泪滴)阴性l豚鼠或人O型血红细胞阳性（环状）阴
66、性阳性阴性阳性阴性882024/7/29中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测892020/3/15参考标准l中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）实验室检测技术指南lWHO:LaboratoryTestingforMiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus： interimrecommendations (revised).(September2014）lUS CDC：Interim Guidelines for Collecting, Handling, andTesting Clinical Specimens from
67、 Patients Under Investigation(PUIs) for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus(MERS-CoV)-Version 2902024/7/29MERS-CoV感染标本采集对象感染标本采集对象l中东呼吸综合征冠状病毒感染疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例；l其它需要进行MERS-CoV感染诊断或鉴别诊断者。912024/7/29标本采集要求1.从事MERS-CoV检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训，培训合格且具备相应的实验技能。在标本采集过程中，采样人员进行安全防护。2.住住院院病病例例的
68、标本由所在医院医护人员在当地疾控机构专业人员指导下采集。3.密切接触者密切接触者标本由当地疾控机构负责采集。4.根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样再次采样。922024/7/29采集标本采集标本种类和要求种类和要求l呼吸道（上、下呼吸道）和其他样品（血清、尿液和粪便）、尸检标本。l每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本，下呼吸道标本最佳，建议同时采集粪便和尿液标本。l应尽可能采取发病初期和恢复期双份血清标本以确定是否感染，双份血清样品间隔1421天采集比较理想，第一份血清应在发病第一周内采集。但单份样品的检测对于确定疑似病例也有价值，如果只能采集一份样品，应该在出现症状后至少14天采
69、集。932024/7/29标本的保存l样品采集后应尽快送至实验室，运输过程需合理。l若呼吸道样品72小时以上才能到达实验室，强烈推荐将样品储存在-80并使用干冰进行运输，应避免样品反复冻融。l从全血分离的血清应4储存并运输，或用干冰、液氮冷冻并运输。由于无霜冰柜温度波动较大，应避免使用无霜冰柜储存呼吸道和血清样品。942024/7/29u院内转运时，标本应该放置在耐用、防渗透的二级容器中进行转运。为减少任何标本破、漏的风险，不要使用任何气动传输系统来转运任何可能疑似患者标本。u转运至CDC的MERS-CoV标本应该充分包裹，转运时不能开盖或分装标本。标本转运应该符合三重包装系统要求：内层是主要
70、的容器（一个可密封的标本袋缠绕以可吸收材料），第二层是防水、防渗漏的容器，外层是用于转运的包装。MERS-CoV感染标本包装和运输952024/7/29 MERS-CoV感染实验室检测感染实验室检测方法方法l核核酸酸检检测测：为目前早期诊断、早期发现MERS-CoV感染病例的主要检测方法，采用Real-time PCR 进行病毒核酸检测和诊断，患者呼吸道样本中扩增到特异性核酸，可确诊MERS-CoV感染 。传统RT-PCR因易出现污染使用受限，但可以获得病毒基因序列。l抗原抗体检测抗原抗体检测:IgM捕获法ELISA检测血清特异性IgM抗体间接法ELISA或免疫荧光方法检测IgG抗体利用假病毒
71、进行中和抗体检测962024/7/29972024/7/29MERS-CoV的实验室检测靶标1.目前病毒核酸的检测方法主要有：检测E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a 、 N2基因四种。2.这些方法均高度敏感，推荐upE检测用于初筛;检测ORF1b基因的方法不如针对ORF1a的方法敏感，但比其更加特异;N2基因检测具有较高的灵敏性。3.另外，已确定了中东呼吸综合征冠状病毒基因组中位于RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）和衣壳蛋白（N）基因的几个适合测序验证的靶序列。982024/7/29巢式巢式PCRPCR普通普通PCRPCRPCRPCR产物电泳或测序产物电泳或测序逆转录，获得逆转
72、录，获得cDNAcDNA核酸提取核酸提取标本采集标本采集PCRPCR检测检测荧光荧光定量定量PCRPCR实验方案99待检样品待检样品upE 特异性RT-PCR检测阳性阴性ORF1a RT-PCR检测阳性阴性确确 诊诊RdRp测序或N 测序阴性抗原检测抗体检测病毒分离阳性实验流程1002024/7/29继续采样，如有必要应送样至有MERS-CoV检测经验的参比实验室进行检测入选病例rRT-PCR upE基因进行筛查实验阳性阴性rRT-PCR ORF1a、ORF1b或N基因区进行确证实验阴性阴性，但如果临床和流行病学证据充分，继续采样重复检测阴性阳性RdRp或N区测序实验阴性显示为其他序列显示ME
73、RS-CoV确诊病例确诊病例1012024/7/29upEupE-Fwd 5-GCAACGCGCGATTCAGTT-3upE-Rev 5-GCCTCTACACGGGACCCATA-3upE-Prb 5FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3ORF1bORF1b-Fwd 5-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3ORF1b-Rev 5-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3ORF1b-Prb 5FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3ORF1aORF1a-Fwd 5- CCACTACTCCCATTTCG
74、TCAG-3ORF1a-Rev 5- CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3ORF1a-Prb 5FAM- TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-TAMRA 3N2N2-Fwd 5- GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3N2-Rev 5- TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3N2-Prb 5FAM- ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ-3分子检测引物与探针1022024/7/29荧光定量RT-PCR检测结果判断阴性: 无Ct值或Ct为40。阳性：Ct值37, 可报告为阳性。Ct值在37-40之间的样本建议重做, 若重做结果Ct
75、值 37，该样本判断为阳性, 否则为阴性。1032024/7/29MERS-CoV核酸检测结果报告核酸检测结果报告在实验室要确认一个样本为阳性，需要满足以下两个条件的其中一个：1.至少两种MERS-CoV特异性PCR结果阳性；2.一种PCR结果为阳性，另外一种PCR产物序列测序，与MERS-CoV序列相符。当针对MERS-CoV的两种不同的检测方法结果不一致的时候，应当采用反转录PCR扩增，对扩增产物进行测序以确认检测结果。1042024/7/29检测结果判读检测结果判读阴性结果也不能排除临床病人的感染，一些因素可能产生假阴性，包括：1.样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；2.样本收集的过
76、早或过晚；3.没有正确的保存、运输和处理样本；4.技术本身存在的原因，如病毒变异，PCR抑制等。当PCR检测结果为阴性，但临床表现和流行病学特点提示是MERS-CoV感染时，可采用血清学方法进行检测。双份血清标本能够满足血清学检测的要求。1052024/7/29我国首例输入性中东呼吸综合征病例的我国首例输入性中东呼吸综合征病例的实验室快速确诊实验室快速确诊2015年5月27日晚10时世界卫生组织向中国卫生计生委通报，韩国1例确诊中东呼吸综合征（MERS）病例的密切接触者经香港入境广东省惠州市。5月28日下午，经广东省疾控中心对病例标本进行核酸检测，初筛结果为阳性。样本接收时间：2015.5.2
77、9日凌晨1点40分（中国疾控中心病毒病所）实验室确诊结果上报： 2015.5.29日凌晨5点40分1062024/7/29疑似疑似MERS-CoV感染的实验室快速确诊感染的实验室快速确诊样本来源：KIM MYEONGSHIK (韩国）广东省惠州市样本类型：鼻咽拭子(3份） 血清(1份）采样日期：2015.5.28实验室复核检测流程：BSL-3实验室：分装灭活 BSL-2实验室：核酸提取 荧光定量RT-PCR (三个靶标UpE、ORF1b和N2) 结果判定与报告 1072020/3/15广东省广东省CDC疑似疑似MERS-CoV感染的复核检测感染的复核检测UpE检测扩增检测扩增曲线曲线ORF1b
78、检测扩增检测扩增曲曲线线N2检测扩增检测扩增曲线曲线1082024/7/29靶标靶标鼻咽拭子鼻咽拭子血血（）（）（）（）（）（）（）（）1 12 23 3UpE 34.1833.933.84No CtNo CtNo CtNo Ct25.51ORF1b 35.8535.1634.73No CtNo CtNo CtNo Ct27.95N2 31.2131.2730.7636.5No CtNo CtND21.34疑似疑似MERS-CoV感染的送检样本复核检测感染的送检样本复核检测荧光定量荧光定量RT-PCR检测结果（检测结果（Ct 值值）109结论l采用upE/ORF1b/N2 三个靶标，进行三种荧光定量RT-PCR扩增，在对照成立的基础上，三管咽拭子样本检测结果皆为阳性。l基于N2靶标的荧光定量RT-PCR扩增，血清标本呈弱阳性。l结论：广东疑似MERS-CoV病人实验室检测确定为MERS-CoV感染阳性。1102024/7/29祝祝各位各位工作工作顺利、生活愉快！顺利、生活愉快！1112024/7/29
