《第二节动物细胞培养》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第二节动物细胞培养（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二节第二节 动物细胞培养动物细胞培养一、一、动物细胞特点动物细胞特点l无细胞壁无细胞壁l倍增时间长，生长缓慢倍增时间长，生长缓慢l需氧量少，对搅拌敏感需氧量少，对搅拌敏感l聚集体形成聚集体形成l原代细胞培养原代细胞培养50代即开始退化代即开始退化二、生长特性二、生长特性l贴附生长型：如人胚肺细胞，贴附生长型：如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞，巨噬细胞，神经细胞细胞l悬浮生长型细胞：如血液白细胞，淋巴组织细胞等悬浮生长型细胞：如血液白细胞，淋巴组织细胞等三、体外培养特点三、体外培养特点l营养条件苛刻营养条件苛刻l适应性差适应性差,敏感敏感l培养时间长，易污染培养时间长，易污染四、
2、体外培养条件四、体外培养条件l温度，温度，37度度lpH：7.2-7.4l气体：氧，二氧化碳，氮气气体：氧，二氧化碳，氮气l营养条件：需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，营养条件：需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供五、五、五、五、 体外细胞生长增殖过程体外细胞生长增殖过程体外细胞生长增殖过程体外细胞生长增殖过程 原代培养期；原代培养期；原代培养期；原代培养期； 传代培养期；传代培养期；传代培养期；传代培养期； 衰退期衰退期衰退期衰退期六、六、六、六、设备、试剂及培养基的选择和配制设备、
3、试剂及培养基的选择和配制设备、试剂及培养基的选择和配制设备、试剂及培养基的选择和配制 1.1.1.1.设备包括培养箱设备包括培养箱设备包括培养箱设备包括培养箱( ( ( (特别是二氧化碳培养箱特别是二氧化碳培养箱特别是二氧化碳培养箱特别是二氧化碳培养箱) ) ) )、无菌室或者、无菌室或者、无菌室或者、无菌室或者超净工作台、光学显微镜特别是倒置显微镜、各种规格的超净工作台、光学显微镜特别是倒置显微镜、各种规格的超净工作台、光学显微镜特别是倒置显微镜、各种规格的超净工作台、光学显微镜特别是倒置显微镜、各种规格的培养瓶培养瓶培养瓶培养瓶( ( ( (包括无钾玻璃的或无毒塑料的、封闭式的或螺口式包括
4、无钾玻璃的或无毒塑料的、封闭式的或螺口式包括无钾玻璃的或无毒塑料的、封闭式的或螺口式包括无钾玻璃的或无毒塑料的、封闭式的或螺口式的等的等的等的等) ) ) ) 2.2.2.2.常用试剂有抗生素常用试剂有抗生素常用试剂有抗生素常用试剂有抗生素 、贴壁因子、生长因子，还需要激素、贴壁因子、生长因子，还需要激素、贴壁因子、生长因子，还需要激素、贴壁因子、生长因子，还需要激素、凝集素、脂多糖凝集素、脂多糖凝集素、脂多糖凝集素、脂多糖(LPS)(LPS)(LPS)(LPS)、各种营养剂胰酶、胶原酶、各种营养剂胰酶、胶原酶、各种营养剂胰酶、胶原酶、各种营养剂胰酶、胶原酶、EDTAEDTAEDTAEDTA、
5、各种生物缓冲剂等各种生物缓冲剂等各种生物缓冲剂等各种生物缓冲剂等3.培养基的选择和配制培养基的选择和配制培养基由三部分组成：基础培养基、血清和基质。培养基由三部分组成：基础培养基、血清和基质。自行配制或用现成的化学合成培养基，常用的化学合成培自行配制或用现成的化学合成培养基，常用的化学合成培养基有养基有Eagle(包括包括BME、MEM、DME等等)、F10、F12、199、RPMI1640、EBSS、HBSS、McCoys5a、Fischers、BGjb、SwimsS77等；培养基中血清的浓度范围为等；培养基中血清的浓度范围为520，以，以10浓度最为常用；浓度最为常用；为维持某些细胞在体外
6、的生机或增殖力，还需要事先在培为维持某些细胞在体外的生机或增殖力，还需要事先在培养基中添加纤黏素、昆布氨酸、白明胶之类的贴壁因子。养基中添加纤黏素、昆布氨酸、白明胶之类的贴壁因子。一般用无水粉剂配制培养基一般用无水粉剂配制培养基，过滤和收集过滤和收集；七、培养方法七、培养方法悬滴；悬滴； 旋转管；灌注小室；培养瓶；旋转管；灌注小室；培养瓶； 培养板培养板原代细胞培养原代细胞培养原代细胞培养原代细胞培养以乳鼠肾细胞原代单层静置培养为例：以乳鼠肾细胞原代单层静置培养为例：以乳鼠肾细胞原代单层静置培养为例：以乳鼠肾细胞原代单层静置培养为例：1 1 1 1、操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放
7、在合适、操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在合适、操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在合适、操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在合适的位置的位置的位置的位置 2 2 2 2、配液：（、配液：（、配液：（、配液：（1 1 1 1）细胞营养液的配置：）细胞营养液的配置：）细胞营养液的配置：）细胞营养液的配置：0 0 0 05 5 5 5LHLHLHLH液；犊牛血清；液；犊牛血清；液；犊牛血清；液；犊牛血清；1 1 1 1万单位万单位万单位万单位/ / / /mlmlmlml青、链霉素；青、链霉素；青、链霉素；青、链霉素；7.4%7.4%7.4%7.4%NaHCONaH
8、CONaHCONaHCO3 3 3 3 （2 2 2 2）平衡盐液平衡盐液平衡盐液平衡盐液HankHankHankHank液的调节；（液的调节；（液的调节；（液的调节；（3 3 3 3）调胰蛋白酶的）调胰蛋白酶的）调胰蛋白酶的）调胰蛋白酶的pHpHpHpH值值值值 ；3 3 3 3、处死动物，取肾，剪肾：将洗过的肾块转移入无菌的青霉、处死动物，取肾，剪肾：将洗过的肾块转移入无菌的青霉、处死动物，取肾，剪肾：将洗过的肾块转移入无菌的青霉、处死动物，取肾，剪肾：将洗过的肾块转移入无菌的青霉素瓶素瓶素瓶素瓶 ；将肾剪成；将肾剪成；将肾剪成；将肾剪成1 1 1 1立方毫米大小的块，组织块的大小应尽量立
9、方毫米大小的块，组织块的大小应尽量立方毫米大小的块，组织块的大小应尽量立方毫米大小的块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用均匀一致，再用均匀一致，再用均匀一致，再用HankHankHankHank液洗涤液洗涤液洗涤液洗涤2 2 2 23 3 3 3次，直到液体澄清为止次，直到液体澄清为止次，直到液体澄清为止次，直到液体澄清为止 ；4 4 4 4、消化及分散组织块，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布、消化及分散组织块，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布、消化及分散组织块，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布、消化及分散组织块，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布（或不锈钢网）进行过滤，以除去部分较大的组织碎片
10、。（或不锈钢网）进行过滤，以除去部分较大的组织碎片。（或不锈钢网）进行过滤，以除去部分较大的组织碎片。（或不锈钢网）进行过滤，以除去部分较大的组织碎片。5 5、计数与释稀：每、计数与释稀：每mlml含细胞含细胞30305050万为宜。万为宜。6 6、分装与培养、分装与培养7 7、 观察：置于观察：置于3737培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察： （1 1）培培养养物物是是否否污污染染，如如培培养养液液变变为为黄黄色色且且混混浊浊，表表示示已已经被污染。经被污染。 （2 2）细细胞胞生生长长状状况况与与培培养养液液颜颜色色的的变变化化，如如培培养养液液变变
11、为为紫紫红红色色，一一般般细细胞胞生生长长不不好好。可可能能是是瓶瓶塞塞未未盖盖紧紧或或营营养养液液pHpH过过高。高。 （3 3）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养。待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养。八、八、组织培养的污染、检测和排除组织培养的污染、检测和排除1.污染的主要途径和媒介的发生污染的主要途径和媒介的发生空气、清洗消毒、操作、血清、组织空气、清洗消毒、操作、血清、组织2.组织细胞污染的检测组织细胞污染的检测真菌污染真菌污染细菌污染细菌污染支原体污染支原体污染3.组织细
12、胞污染的排除组织细胞污染的排除抗生素除菌法、加温除菌法、动物体内接种除菌法、抗生素除菌法、加温除菌法、动物体内接种除菌法、巨噬细巨噬细胞吞噬法胞吞噬法九、动物细胞培养九、动物细胞培养应用应用1962年开始，用于生物医学研究，生产酶年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因制剂，生长因子，疫苗，单抗等子，疫苗，单抗等.如：如：单克隆抗体技术在现代医学中的应用单克隆抗体技术在现代医学中的应用;胚胎移植和核移植技术在畜牧业中的应用胚胎移植和核移植技术在畜牧业中的应用动物细胞大量培养生产次生产物动物细胞大量培养生产次生产物动物克隆技术的应用潜力动物克隆技术的应用潜力单克隆抗体克隆抗体 1975197
13、5年英国科学家年英国科学家Milstein和和Kohler将将产生抗体生抗体 的淋巴的淋巴细胞同胞同肿瘤瘤细胞融合，成功建立了胞融合，成功建立了单克隆抗克隆抗 体技体技术，而，而获得得1984年年诺贝尔医学和生理学医学和生理学奖。 每个每个B淋巴淋巴细胞胞仅专一地一地产生、分泌一种生、分泌一种针对某某 种抗原决定簇的特异性抗体，而种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤瘤细胞可以无限胞可以无限 增殖，因此增殖，因此杂交瘤交瘤细胞可在体外培养或移植到体内胞可在体外培养或移植到体内 条件下分泌大量条件下分泌大量单克隆抗体。克隆抗体。 单克隆抗体技克隆抗体技术的最主要的最主要优点是可以用不点是可以用不纯的抗
14、的抗 原分子大量制原分子大量制备纯一的一的单克隆抗体。克隆抗体。杂交交瘤瘤细胞胞产生生单克克隆隆抗抗体体示示意意图第三节第三节 克隆技术及其应用的简介克隆技术及其应用的简介 一、克隆技术的分类一、克隆技术的分类根据克隆的层次分为基因克隆、细胞克隆、组织克隆、器官根据克隆的层次分为基因克隆、细胞克隆、组织克隆、器官克隆及完整的生物体克隆。克隆及完整的生物体克隆。(1)(1)基基因因克克隆隆是是指指通通过过分分子子重重组组技技术术或或是是扩扩增增（如如PCRPCR扩扩增增）DNADNA片断的相同序列的大量拷贝片断的相同序列的大量拷贝 ，它是深入研究基因的结构、转化、表达、调控及进行基因，它是深入研
15、究基因的结构、转化、表达、调控及进行基因改造的基础。改造的基础。 (2)(2)细细胞胞克克隆隆、组组织织克克隆隆和和器器官官克克隆隆是是克克隆隆技技术术在在细细胞胞水水平平、组组织织水水平平和和器器官官水水平平上上的的应应用用，可可用用来来生生产产大大量量相相同同的的细细胞、组织和器官。胞、组织和器官。分为植物克隆和动物克隆等分为植物克隆和动物克隆等 生物繁殖后代通常是以精、卵生物繁殖后代通常是以精、卵细胞胞结合的有性生殖方式合的有性生殖方式进行。通行。通过营养体养体细胞繁殖个体的方法称胞繁殖个体的方法称为无性繁殖。克隆无性繁殖。克隆是指离体条件下的无性繁殖。是指离体条件下的无性繁殖。1981
16、年年Illmenses率先率先报告用小告用小鼠幼胚鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。随后，胞核克隆出正常小鼠。随后，1984年年Willadsen用未用未成熟羊胚成熟羊胚细胞核克隆出一胞核克隆出一头羊。羊。 英国英国PPI生物技生物技术的的罗斯林（斯林（Roslin）研究所的研究所的维尔穆特穆特(Wilmut)博士博士1997年年2月月27日在世界著名日在世界著名权威威杂志志Nature宣布的用乳腺宣布的用乳腺细胞的胞的细胞核克隆出一只胞核克隆出一只绵羊羊“多莉多莉(Dolly)”的消息。的消息。“多莉多莉”的的诞生，既生，既说明了体明了体细胞胞核的核的遗传全能性，也翻开了人全能性，也翻开了人类以体
17、以体细胞核胞核竞相克隆哺乳相克隆哺乳动物的新篇章。此物的新篇章。此项技技术因而荣登美国因而荣登美国Science周刊周刊评出出的的1997年十大科学年十大科学发现的榜首。的榜首。 二、克隆过程二、克隆过程 科学家选取了三只母羊，通过显微操作先将一只母羊科学家选取了三只母羊，通过显微操作先将一只母羊的卵细胞核质分离，使卵失去原有的的卵细胞核质分离，使卵失去原有的遗传物质，仅余遗传物质，仅余细胞质；细胞质；然后将另一只然后将另一只6岁母羊的乳腺细胞的核与之融合，形成岁母羊的乳腺细胞的核与之融合，形成一个含有一个含有新遗传物质的卵细胞；新遗传物质的卵细胞；使核质融合的卵在体外培养发育为早期胚胎；使核质融合的卵在体外培养发育为早期胚胎；当这一胚胎生长到当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊“多莉多莉”。绵羊羊B乳腺乳腺细胞核胞核易核卵易核卵融合卵融合卵绵羊羊C子子宫多莉多莉植入植入植入植入生生产克克隆隆多多莉莉羊羊示示意意图图取出取出未受精卵未受精卵去核去核电激激体外胚胎体外胚胎发育育绵羊羊A多莉多莉克隆猴克隆猴
