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1、实验八实验八实验八实验八 产淀粉酶菌种的鉴定产淀粉酶菌种的鉴定产淀粉酶菌种的鉴定产淀粉酶菌种的鉴定1;.实验目的实验目的1.1.了解微生物分类与鉴定中的基本程序和常规实验技术与方法；了解微生物分类与鉴定中的基本程序和常规实验技术与方法；2.2.熟悉熟悉16S rRNA16S rRNA基因基因PCRPCR扩增进行细菌鉴定的基本原理并初步掌握扩增进行细菌鉴定的基本原理并初步掌握PCRPCR的操作技术；的操作技术；3.3.初步学会网上的有关网站的微生物资源信息和数据库的使用并利用其进行细菌初步学会网上的有关网站的微生物资源信息和数据库的使用并利用其进行细菌鉴定分析。鉴定分析。2实验原理实验原理实验原
2、理实验原理 n n细菌分类鉴定的方法：细菌分类鉴定的方法：1. 1.形态学特征的鉴定形态学特征的鉴定2. 2.生理生化特征的鉴定生理生化特征的鉴定3. 3.分子特征的鉴定分子特征的鉴定3形态学的鉴定形态学的鉴定形态学的鉴定形态学的鉴定n n固体平板菌落，固体斜面，半固体穿刺，液体的培养特征；固体平板菌落，固体斜面，半固体穿刺，液体的培养特征；n n显微镜下的细胞形状，革兰氏染色反应，抗酸性染色，是否具有芽孢（芽孢显微镜下的细胞形状，革兰氏染色反应，抗酸性染色，是否具有芽孢（芽孢在细胞内的位置）、荚膜和鞭毛（鞭毛着生的位置）等。在细胞内的位置）、荚膜和鞭毛（鞭毛着生的位置）等。 4分子鉴定分子鉴
3、定分子鉴定分子鉴定n n16SrDNA 16SrDNA 是编码原核生物核糖体是编码原核生物核糖体RNARNA小亚基小亚基16SrRNA 16SrRNA 的基因，与细菌整个基因组的变化的基因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的保守性，其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致的，所以相比，它具有高度的保守性，其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致的，所以有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库，有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库，16SrDNA 16SrDNA 序列分析可以快速准确的对序列分析可以快速准确的对细菌进行种属鉴定，确定细菌在进化中的位置。细菌进行种属鉴定，确定细菌在进化中
4、的位置。n n16SrDNA 16SrDNA 序列包含序列包含1010个可变区和与之相间的个可变区和与之相间的1111个恒定区。根据恒定区的保守性可以设个恒定区。根据恒定区的保守性可以设计出细菌的通用引物，并且扩增出所有细菌的计出细菌的通用引物，并且扩增出所有细菌的16SrDNA 16SrDNA 片段。可变区因细菌而异，能片段。可变区因细菌而异，能够揭示生物物种特征核酸序列，是种属鉴定的分子基础。够揭示生物物种特征核酸序列，是种属鉴定的分子基础。n n扩增细菌的扩增细菌的16SrDNA 16SrDNA 基因需要其染色体基因需要其染色体DNA DNA 作为模板进行作为模板进行PCRPCR， 可以
5、提取细菌染色体可以提取细菌染色体DNA DNA 作为模板，也可以直接挑取平板上经过活化的菌落做作为模板，也可以直接挑取平板上经过活化的菌落做PCR PCR 以达到快速简便的目的。以达到快速简便的目的。5PCRPCR的原理和步骤的原理和步骤的原理和步骤的原理和步骤n n原理原理 PCRPCR是一种由引物介导的选择性体外扩增是一种由引物介导的选择性体外扩增DNADNA的方法。的方法。n n步骤步骤1.1.变性（变性（DenatureDenature）：）：目的双链目的双链DNADNA片段在片段在9595下解链；下解链；2.2.退火（退火（AnnealAnneal）：）：两种引物在适当温度（两种引物
6、在适当温度（59 59 左右）下与模板上的互补序列通过左右）下与模板上的互补序列通过氢键配对；氢键配对；3.3.延伸（延伸（ExtensionExtension）：）：在在TaqTaq DNA DNA聚合酶合成聚合酶合成DNADNA的最适温度下，以目的的最适温度下，以目的DNADNA为模板为模板进行合成。进行合成。 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNADNA扩增一倍，这些扩增一倍，这些合成的合成的DNADNA又可作为下一轮循环的模板，所以经又可作为下一轮循环的模板，所以经25-3525-35轮循环就可使轮循环就可使D
7、NADNA扩增达扩增达10106 6 倍。倍。65533PCR Cycle 1Denaturation 95 strands separate PrimersTaqTaqTaq polymerase is thermostable73553Annealing59 Primers bindTaqTaqForward primer anneals to lower strandReverse primer anneals to upper strandPCR Cycle 183553Taq synthesises DNA in the 5 to 3 directionPCR Cycle 1TaqT
8、aqExtension72 Taq copies DNA strand dNTPs9琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理n n原理：原理： 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极泳动的现象。带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极泳动的现象。 在本实验中，在本实验中，DNADNA分子带负电荷，向正极泳动。分子带负电荷，向正极泳动。n n影响泳动率的因素：影响泳动率的因素： 电荷效应和分子筛效应（即电荷效应和分子筛效应（即DNADNA分子本身的大小和构型）。分子本身的大小和构型）。 在本实验中，分子量越小，泳动越快。在本实验中，分子量越小
9、，泳动越快。10实验器材实验器材1. 1. 产淀粉酶的待检菌的平板菌落（提前产淀粉酶的待检菌的平板菌落（提前2424小时接种）；小时接种）；2. 2. 革兰氏染色全套试剂，载玻片，酒精灯，接种环，光学显微镜；革兰氏染色全套试剂，载玻片，酒精灯，接种环，光学显微镜；3. PCR3. PCR反应试剂：反应试剂：TaqTaq酶，反应缓冲液，酶，反应缓冲液，dNTPdNTP，16S rRNA 16S rRNA 基因上下游引物，模板基因上下游引物，模板（菌落）；（菌落）；4. 4. 琼脂糖，溴化乙锭，凝胶电泳仪，水平电泳槽，紫外检测灯，琼脂糖，溴化乙锭，凝胶电泳仪，水平电泳槽，紫外检测灯，TAETAE电
10、泳缓冲液；电泳缓冲液；5. 5. 微量移液枪，枪头，微量移液枪，枪头，PCRPCR管，管，PCRPCR仪。仪。 11实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤 （一）产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征的观察与鉴定（一）产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征的观察与鉴定 1.1.培养特征的观察：菌落形状与大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落与培养基颜培养特征的观察：菌落形状与大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落与培养基颜色等；色等； 2.2.细菌细胞的显微观察：细胞形状是杆状（长杆或短杆）还是球状？有无芽孢？有无荚膜细菌细胞的显微观察：细胞形状是杆状（长杆或短杆）还是球状？有无芽孢？有无荚膜？ 3.3
11、.细菌的革兰氏染色：按照实验二的操作方法进行（设立标准的革兰氏阳性和阴性菌为对细菌的革兰氏染色：按照实验二的操作方法进行（设立标准的革兰氏阳性和阴性菌为对照）。照）。12（二）细菌的（二）细菌的16S rRNA16S rRNA分子鉴定分子鉴定用灭菌牙签挑取单菌落于用灭菌牙签挑取单菌落于2020 ul PCR ul PCR管中，管中，加热加热10min,10min,离心离心2min2min。反应体系：在一个反应体系：在一个PCRPCR管中用微量移液枪加入下列物质的混合液管中用微量移液枪加入下列物质的混合液2020ulul，和，和5 5 ul ul菌菌液液, ,置于冰上备用。置于冰上备用。 Taq
12、 bufferTaq buffer（1010） MgCl2 MgCl2（25mM25mM） dNTP dNTP（2.5 mM2.5 mM） Primer Forward Primer Forward（50 mM50 mM） Primer Reverse Primer Reverse（50 mM50 mM） ddH2O ddH2O 震荡，将菌体和反应体系充分混匀震荡，将菌体和反应体系充分混匀 最后加入：最后加入：rTaqrTaq（2U/ul2U/ul） 0.5ul0.5ulPCRPCR反应条件：反应条件：9494预变性预变性2 min2 min后，后，9494变性变性1 min1 min，555
13、5退火退火1min1min，7272延伸延伸2min2min，共，共25-3025-30个循环，个循环，7272延伸延伸10min10min。 混合液24.5ul13（三）琼脂糖凝胶电泳（三）琼脂糖凝胶电泳 1.1.制胶：配制制胶：配制0.7%0.7%琼脂糖溶液琼脂糖溶液20mL20mL，用，用1TAE1TAE电泳缓冲液做溶剂，加热溶解，电泳缓冲液做溶剂，加热溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待胶凝固；稍冷后，加入模具中，插入梳子，待胶凝固； 2.2.制样：制样：PCRPCR反应结束后，取出反应结束后，取出PCRPCR管，用微量移液枪吸取管，用微量移液枪吸取5ul5ul与与1ul 61ul
14、6样品样品BufferBuffer混合后全部点入浸于混合后全部点入浸于TAETAE电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶的样品孔中电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶的样品孔中; ; 3. 3.电泳：电泳：100V100V电泳电泳2020分钟；分钟； 4.4.染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色；染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色；10min10min，然后将凝胶置于紫外，然后将凝胶置于紫外灯下进行检测，当在凝胶上出现预期大小的灯下进行检测，当在凝胶上出现预期大小的DNADNA条带（约条带（约1.5Kb1.5Kb），则认为是），则认为是PCRPCR阳性，这时将与此电泳样品对应的阳性，这时将与此电泳样品对应的PCR
15、PCR反应管放置冰箱短期保存。反应管放置冰箱短期保存。 14（四）（四）PCRPCR扩增片段测序扩增片段测序 获得的获得的PCRPCR阳性样品由专人送往测序公司进行测序，大约一周后测序结果阳性样品由专人送往测序公司进行测序，大约一周后测序结果可以返回，然后在电脑的相关软件上进行读序。可以返回，然后在电脑的相关软件上进行读序。（五）序列比对分析（五）序列比对分析 使用使用NCBI NCBI 网站对待测菌的网站对待测菌的16SrDNA 16SrDNA 序列与数据库中各种菌的序列与数据库中各种菌的16SrDNA 16SrDNA 序列序列进行比对。登陆进行比对。登陆 美国国立生物技术信息中心网站，使用
16、美国国立生物技术信息中心网站，使用BLASTn BLASTn 在在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索。从基因库中进行同源性搜索。从Genebank Genebank 中选择近中选择近与待测菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的与待测菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的16SrRNA16SrRNA基因序列基因序列, , 初初步确定待测菌的分类位置。用步确定待测菌的分类位置。用ClustalClustal软件将已知分类菌株的软件将已知分类菌株的16SrRNA16SrRNA序列与序列与待测菌的待测菌的16SrR
17、NA16SrRNA序列进行多序列比较。序列进行多序列比较。15实验报告实验报告1.1.描述你所分离菌的形态学特征：菌落特征，细胞形态和革兰氏反应等结果；描述你所分离菌的形态学特征：菌落特征，细胞形态和革兰氏反应等结果；2.2.根据根据PCRPCR产物的测序以及网上比对的结果，分离菌可以归类到哪一种菌？产物的测序以及网上比对的结果，分离菌可以归类到哪一种菌？16实验思考实验思考1.1.细菌的鉴定工作对于发掘微生物种质资源的意义是什么？细菌的鉴定工作对于发掘微生物种质资源的意义是什么？2.2.为什么说为什么说16S rRNA16S rRNA序列分析方法是微生物分类与鉴定的金标准？序列分析方法是微生物分类与鉴定的金标准？17
