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1、实时定量实时定量PCR (real-time quantitative PCR)报告人：杨霞报告人：杨霞报告人：杨霞报告人：杨霞2012-5-112012-5-112012-5-112012-5-11目录目录一、实验原理二、实验优点三、实验缺点四、实验应用五、实验简介实时定量PCR(real-timequantitativePCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。评估基因表达水平等方面的工作,并在不需要构建和筛选cDNA文库的前提下，完成对cDNA片段的克隆一、实验原理一、实验原理 该技术
2、不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图荧光扩增曲线图 ( 如下图) 。实时荧光扩增曲线图实时荧光扩增曲线图 二、实验优点二、实验优点原理不同：荧光定量pcr实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光；普通pcr通过检测插入dna中核酸染料的量来测定pcr最终
3、产物量，一般是紫外光。反应要求：荧光定量对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp；普通定量可以扩增长的片段。如果不需要检测产物分子量大小，荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析，普通pcr必须电泳。结果：荧光定量可以实现精确定量，普通pcr则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程，可以看到扩增效率，溶解温度，直接得到的标准曲线等，这些是普通pcr无法实现的。三、实验缺点三、实验缺点实验费用贵实验重复次数多：生物重复和技术重复四、应用四、应用科学研究：科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。临床疾病床疾病诊断：断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；
4、地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。动物疾病物疾病检测：禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。食品安全：食品安全： 食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。应用行用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。五、实验简介五、实验简介定量定量PCR试剂体系试剂体系试剂初始初始浓度度终浓度度加入体加入体积(L)Buffer101 2.5dNTPs2mM200 M2.5Mg2+25 mM4 6 m
5、M4 - 6Primers20 M400 800 nM0.5 - 1Probe / sybr green10 M120 200 nM0.3 0.5Taq5 U/L1.5 U0.3Template1-20 ng/L5 100 ng5 LddH2O补足足 25L为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了几个重要的概念：基基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。荧光光阈值（threshold）：）：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）
6、荧光信号的标准偏差的10倍。荧光域值是PCR315个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。CT 值（值（ threshold value ）：）：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值。 研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数起始拷贝数。荧光定量荧光定量PCR化学原理化学原理1 1、SYBR Green SYBR
7、Green （荧光染料掺入法）（荧光染料掺入法） 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 2 2、TaqMan TaqMan （探针法）（探针法）PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基 团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可
8、接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。1、SYBR Green 法法 2、SYBR Green 法的优缺点法的优缺点2、TaqMan探针法探针法 TaqMan作用机理作用机理 TaqMan法优缺点法优缺点 注意事项注意事项 一、防止一、防止RNA酶污染酶污染二、一定要做内参的。不作内参的结果是不可信的。二、一定要做内参的。不作内参的结果是不可信的。注意事项注意事项 内参：PCR时，每个标本都要做对应的内参，而且每次都是看家看家基因基因，一般用bate-actin，有时也用GAPDH。 内参的选择：内参的选择：普通PCR内参的大小没有多大要求，但realtime一般选择300bp以下。它的作用在于你提取的RNA逆转录成cDNA时，加入的浓度可能会不一致，即使用分光广度计测其浓度，也会有仪器误差，跑出的条带要进行灰度分析。用目的基因的积分光密度比上内参的光密度就是你这个基因实际表达的量。
