药物分析学：各论第五章抗菌药物与抗生素类的分析

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1、第五第五章章 抗菌药物与抗生素类抗菌药物与抗生素类药物的分析药物的分析药物分析学 各论药物分析教研室药物分析教研室徐新军徐新军E-mail:TEL:39330341;13924061778教学内容教学内容 - -内酰胺类内酰胺类12抗菌药物喹诺酮类抗菌药物喹诺酮类 四环素类四环素类34 氨基糖苷类氨基糖苷类 学习要求学习要求掌握掌握各类药物结构、性质、质量分析特点各类药物结构、性质、质量分析特点有关物质的来源与检查方法有关物质的来源与检查方法体内样品分析与临床检测体内样品分析与临床检测熟悉熟悉了解了解第一节第一节 喹诺酮类喹诺酮类抗菌抗菌药物的分析药物的分析一、结构通式一、结构通式(F)6-氟

2、氟-4-喹诺酮喹诺酮-3-羧酸羧酸化学合成抗菌药，由于抗菌谱广、抗菌作用强，使用安全，易于制造,得到迅速发展。代表药物代表药物第一代药物：第一代药物： 第二代药物：第二代药物： 萘啶酸萘啶酸吡哌酸吡哌酸 哌嗪基代表药物代表药物第三代药物：第三代药物： 诺氟沙星诺氟沙星环丙沙星环丙沙星氧氟沙星氧氟沙星 *代表药物代表药物第四代药物：第四代药物： 左氧氟沙星左氧氟沙星 司帕沙星司帕沙星加替沙星加替沙星莫西沙星莫西沙星结构与性质结构与性质二、喹诺酮类药物的理化性质二、喹诺酮类药物的理化性质溶 解 性酸碱两性紫外吸收旋 光 性4123一般为类白色或淡黄色结晶 分解反应56与金属离子反应（一）两性与溶解

3、性（一）两性与溶解性1、与酸、碱均能成盐、与酸、碱均能成盐2、酸性或碱性溶液中溶解度、酸性或碱性溶液中溶解度 羧基羧基 弱酸性弱酸性氮原子氮原子 弱碱性弱碱性结构与性质结构与性质（二）紫外吸收（二）紫外吸收结构与性质结构与性质（三）旋光性（三）旋光性结构与性质结构与性质氧氟沙星氧氟沙星 左氧氟沙星左氧氟沙星 （四）与金属离子络合（四）与金属离子络合结构与性质结构与性质与钙、镁、铁、锌等离子形成螯合物与钙、镁、铁、锌等离子形成螯合物不宜与牛奶等食物或药品同服不宜与牛奶等食物或药品同服长期服用会引起缺铁、缺钙等长期服用会引起缺铁、缺钙等 三、鉴别试验三、鉴别试验与丙二酸反应 A AB BC CD

4、DE E与丙二酸反应 与丙二与丙二酸酸呈色反应呈色反应UV法法TLC法法HPLC法法IR法法叔胺基团棕红-红-紫-蓝（一一） 与丙二酸的反应与丙二酸的反应鉴别试验鉴别试验 示例示例 诺氟沙星乳膏的鉴别：诺氟沙星乳膏的鉴别：取含量测定项下的供试品溶液取含量测定项下的供试品溶液5ml，置水浴上，置水浴上蒸干，残渣中加丙二酸约蒸干，残渣中加丙二酸约50mg与酸酐与酸酐1ml，在，在水浴中加热水浴中加热10分钟，溶液显红棕色。分钟，溶液显红棕色。 精密称取本品适量（约相当于诺氟沙星精密称取本品适量（约相当于诺氟沙星4mg），置分液漏斗中，加），置分液漏斗中，加氯仿氯仿15ml，振，振摇后，用摇后，用氯

5、化钠氯化钠饱和的饱和的0.1氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液25、20、20和和10ml分次提取，提取液置分次提取，提取液置100ml量瓶中，加量瓶中，加0.1氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精，精密量取续滤液密量取续滤液10ml，加，加0.4氢氧化钠溶液制成每氢氧化钠溶液制成每1ml中含中含5g的溶液，照分光光的溶液，照分光光度法（附录度法（附录A），在），在273nm的波长处测定吸收度；另精密称取诺氟沙星对照品的波长处测定吸收度；另精密称取诺氟沙星对照品叔胺化合物叔胺化合物（二二） 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法鉴别试验鉴别试验

6、示例示例 左氧氟沙星的左氧氟沙星的UV鉴别：鉴别： 取供试品适量，加取供试品适量，加0.1mol/L 盐酸溶液盐酸溶液溶解并稀释制成每溶解并稀释制成每1ml中约含中约含5g 的溶液，的溶液，在在226nm与与294nm的波长处有最大吸收，的波长处有最大吸收，在在263nm的波长处有最小吸收。的波长处有最小吸收。 注意鉴别的专属性鉴别试验鉴别试验 ( (三三) )TLCTLC法法ChP2010ChP2010对氧氟沙星、诺氟沙星和氟罗沙星用对氧氟沙星、诺氟沙星和氟罗沙星用TLCTLC法鉴别。法鉴别。氟罗沙星氟罗沙星 【示例示例】取供试品与氟罗沙星对照品适量，加三氯取供试品与氟罗沙星对照品适量，加三

7、氯甲烷甲烷- -甲醇甲醇(4:1)(4:1)制成每制成每1ml1ml含含1mg1mg的溶液，分别作为供的溶液，分别作为供试品溶液与对照品溶液；另取氟罗沙星对品与氧氟沙试品溶液与对照品溶液；另取氟罗沙星对品与氧氟沙星对照品适量，加三氯甲烷星对照品适量，加三氯甲烷- -甲醇甲醇(4:1)(4:1)制成每制成每1ml1ml含氟含氟罗沙星罗沙星1mg1mg和氧氟沙星和氧氟沙星1mg1mg的混合溶液，作为系统适用的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。性试验溶液。 吸取上述三种溶液各吸取上述三种溶液各2l2l，分别点于同一，分别点于同一硅胶硅胶GF254GF254薄层板上，以乙酸乙酯薄层板上，以乙酸乙酯-

8、-甲醇甲醇- -浓浓氨溶液氨溶液(5:6:2)(5:6:2)为展开剂，展开，取出，晾为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯干，置紫外灯(254nm)(254nm)下检视，系统适用性下检视，系统适用性试验应显示两个清晰分离的斑点，供试品试验应显示两个清晰分离的斑点，供试品溶液所显主斑点的位置和荧光应与对照品溶液所显主斑点的位置和荧光应与对照品溶液主斑点的位置和荧光相同。溶液主斑点的位置和荧光相同。 ChP2010ChP2010规定：喹诺酮类药物含量测定项下规定：喹诺酮类药物含量测定项下的供试品主峰应与相应对照品主峰的保留的供试品主峰应与相应对照品主峰的保留时间一致。时间一致。ChP2010ChP2

9、010收载的喹诺酮类药物均收载的喹诺酮类药物均采用采用高效液相色谱法高效液相色谱法进行鉴别。进行鉴别。鉴别试验鉴别试验(四四)HPLC法法鉴别试验 (五)IR法法盐酸环丙沙星盐酸环丙沙星的鉴别：供试品的的鉴别：供试品的红外光吸红外光吸收收图谱应与对照的图谱一致。图谱应与对照的图谱一致。 四、特殊杂质检查l左氧氟沙星光学杂质(右氧氟沙星)l 环丙沙星中有关物质的HPLC检查 特殊杂质检查特殊杂质检查示例示例 左氧氟沙星光学杂质左氧氟沙星光学杂质(右氧氟沙星右氧氟沙星)的的HPLC检查：检查：配合交换手性流动相法（HPLC）色谱条件1.0mg/ml10g/ml 0.2mg/ml各20l供试品溶液

10、40 294nm 硫酸铜-D-苯丙氨酸-甲醇(82:18)C18柱对照品溶液 进样氧氟沙星对照品 特殊杂质检查特殊杂质检查示例示例 环丙沙星中有关物质的环丙沙星中有关物质的HPLC检查：检查：五、含量测定非水溶液滴定 紫外法HPLC法盐酸洛美沙星盐酸洛美沙星左氧氟沙星左氧氟沙星 ChP2010吡哌酸的含吡哌酸的含量采用量采用非水溶液滴定法非水溶液滴定法ChP2010诺氟沙星诺氟沙星乳膏含量乳膏含量测定采用测定采用UV含量测定含量测定（一）非水溶液滴定法（一）非水溶液滴定法 示例示例 吡哌酸含量的非水溶液滴定测定吡哌酸含量的非水溶液滴定测定 ：取供试品约取供试品约0.2g，精密称定，加冰醋酸，精

11、密称定，加冰醋酸20ml溶解后，加结晶紫指示液溶解后，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定滴，用高氯酸滴定液液(0.1mol/L)滴定至溶液显纯蓝色，并将滴定滴定至溶液显纯蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于相当于30.33mg的的C14H17N5O3 。 专属性不强含量测定含量测定（一）非水溶液滴定法（一）非水溶液滴定法 注意事项注意事项 ：1、严格控制醋酐加入量，并用水分测定法调、严格控制醋酐加入量，并用水分测定法调节至滴定液含水量为节至滴定液含水量为0.01%0.2%。否则结果。否则结果明显偏低。明显偏低。2、

12、亦可在二甲基甲酰胺溶液中，以麝香草酚、亦可在二甲基甲酰胺溶液中，以麝香草酚蓝为指示剂用甲醇钠标准溶液滴定。蓝为指示剂用甲醇钠标准溶液滴定。 含量测定含量测定（二）紫外分光光度法（二）紫外分光光度法示例示例 诺氟沙星乳膏含量的诺氟沙星乳膏含量的UV测定测定 ：（三）高效液相色谱法（三）高效液相色谱法示例示例 盐酸洛美沙星含量的戊烷磺酸钠离子盐酸洛美沙星含量的戊烷磺酸钠离子对对HPLC 测定测定 含量测定含量测定 对照品溶液的制备 精密称取在105干燥至恒重的诺氟沙星对照品适量,加氢氧化钠液（0.02mol/L）制备成每1ml中含4g的废液。 供试品溶液的制备精密称取适量（约相当于诺氟沙星4mg）

13、置分液漏斗中，加氯仿15ml，振摇使膏体溶解后，用氢氧化钠液（0.02mol/L）25、20、20与10m（分次提取（每次提取时加饱和氯化钠溶液1ml）收集提取液置100ml量瓶中，用氢氧化钠液（0.02mol/L）稀释至刻度，滤过，弃去初滤液，精精密量取续滤液10ml，置100ml量瓶中，用氢氧化钠液（0.02mol/L）稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 取对照品溶液与供试品溶液，照分光光度法（中国药典1990年版二部附录24页），在273nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。诺氟沙星乳膏含量的诺氟沙星乳膏含量的UV测定测定示例离子对色谱外标法检测波长287nm 流动相戊烷磺酸钠溶液 -甲

14、醇(65:35) 供试品溶液约含洛美沙星（0.1mg/ml）20 l对照品溶液洛美沙星（1.0mg/ml）20 l C18柱示例离子对色谱外标法检测波长294nm 醋酸铵高氯酸钠 溶液-乙腈(85:15) 流动相供试品溶液供试品约60mg 混合对照溶液左氧氟沙星0.12mg /ml环丙沙星6g /ml杂质E 6g /ml C18柱50ml取5ml10l进样500ml另取左氧氟沙星对照品适量，同法测定 第二节第二节 - -内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素分分析析青霉素的发现第一个用于临床的抗生素第一个用于临床的抗生素由青霉菌的培养液中分离而得由青霉菌的培养液中分离而得药物分析那一年的夏天，弗莱明把细

15、菌培养基放在桌上度假去了。之后恰好有9天的时间天气特别凉爽，于是青霉得以生长，而葡萄球菌则难以生长。然后气温上升，葡萄球菌开始生长，但这时青霉已产生了足够的青霉素来杀死周围的葡萄球菌。弗莱明过完一个月的假期回来后，并没有注意到这个培养基有何异样，而是将它和其他被污染的培养基一起扔进消毒液中。刚好他以前的助手来访，弗莱明为了介绍自己的工作，给他看了几个细菌培养，顺手从准备消毒的一堆培养皿中拿了最上面的还没浸泡的那个来看，这才注意到这一个有些异样。如果弗莱明没有去度长假，如果污染其细菌培养的不是青霉，如果那一段时间的气温没有先凉后热，如果消毒液淹没了培养基，如果他的前同事不是刚好来访，这些环节只要

16、有一个没有发生，这一切就都不会出现了。发现了青霉的抗菌作用后，他立即想到可以从中开发出抗菌药物。他分离出能抗菌的青霉提取液，把它命名为青霉素，并发现它能抑制多种细菌的生长。1929年弗莱明在英国实验病理学杂志上报道了其发现。 药物分析青霉素作为一种药物，最终是由牛津大学的霍华德弗洛里实验室开发出来的。1938年，犹太人恩斯特钱恩逃离纳粹德国到了英国，在弗洛里实验室工作，其课题是研究天然抗菌物质，他读到了弗莱明1929年的论文，立即很感兴趣。他设法提取出了一些相对比较纯的青霉素，想用它在老鼠身上试一试。但是钱恩是个生物化学家，没有资格做动物试验，几次向弗洛里提出试验要求，弗洛里都很冷淡。后来，钱

17、恩趁弗洛里不在，找一个同事帮忙，给两只被细菌感染的老鼠注射了青霉素。两只老鼠都康复。弗洛里获悉实验结果后，才对青霉素发生了兴趣。在他的领导下，组织了一支强大的研发队伍，生产出更多、更稳定的青霉素，开始了人体试验，并在美国进行大规模的生产。生产出来的青霉素首先被用于拯救盟军受伤战士，避免因受伤感染导致的死亡，据估计，青霉素救了12%-15战士的生命。战争结束后，青霉素即转为民用。1945年，弗莱明、弗洛里、钱恩三人分享诺贝尔医学奖。但是一般人都只知道弗莱明发现了青霉素，不知道青霉素能从实验室走向临床、变成救人无数的良药，主要得归功于钱恩和弗洛里。（青蒿素的发现）药物分析药物分析 抗生素类抗生素类

18、发展史发展史u1929年，弗来明年，弗来明(Alexander Fleming) 发现发现青霉素。青霉素。u1958年谢汉合成年谢汉合成6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6-APA)成成功。开创了半合成青霉素的时代功。开创了半合成青霉素的时代u1961年，头孢菌素年，头孢菌素C被发现，头孢菌素迅速被发现，头孢菌素迅速发展。发展。u80年代年代:广谱碳青霉烯类上市。广谱碳青霉烯类上市。药物分析药物分析细心与协作精神的胜利青霉素的发现始于一个现象的意外青霉素的发现始于一个现象的意外观察，而我唯一的功劳仅是没有忽观察，而我唯一的功劳仅是没有忽视观察。视观察。A.leming药物分析细心与协作精神的胜利化

19、学家和经过生物学训练或具有生化学家和经过生物学训练或具有生物学知识的行家之间的合作是非常物学知识的行家之间的合作是非常关键之处，这也是在此之前对大批关键之处，这也是在此之前对大批已知抑制剂的研究成果甚少的原因已知抑制剂的研究成果甚少的原因之所在。之所在。Florey药物分析第二节第二节 -内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素青霉素类青霉素类头孢菌素类头孢菌素类青霉素类青霉素类(penicillins)母核为母核为6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6-AminopenicillanicAcid，6-APA)AB1234567头孢菌素类头孢菌素类(cephalosporins)母核称为母核称为7-氨基头孢菌烷

20、酸氨基头孢菌烷酸(7-AminocephalosporanicAcid，7-ACA)AB12356784青霉素代表药物代表药物氨苄西林（氨苄青霉素）氨苄西林（氨苄青霉素）代表药物代表药物阿莫西林（羟氨苄青霉素）阿莫西林（羟氨苄青霉素）代表药物代表药物头孢氨苄头孢氨苄代表药物代表药物头孢头孢拉定拉定代表药物代表药物头孢氨苄头孢拉定头孢拉定头孢羟氨苄头孢羟氨苄代表药物代表药物头孢噻吩钠头孢噻吩钠代表药物代表药物结构特点与性质结构特点与性质青霉素类青霉素类头孢菌素类头孢菌素类（一）羧基：酸性（一）羧基：酸性 与碱金属与碱金属( (Na+、K+)成盐成盐 易溶于水易溶于水 （青霉素钾、钠）（青霉素钾、

21、钠）结构特点与性质结构特点与性质Na（一）羧基：酸性（一）羧基：酸性 结构特点与性质结构特点与性质与有机碱与有机碱( (普鲁卡因普鲁卡因) )成盐：难溶于水成盐：难溶于水 普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素头孢菌素类头孢菌素类青霉素类青霉素类（二）手性碳原子：旋光性（二）手性碳原子：旋光性 结构特点与性质结构特点与性质 C6 C7 C2 C5 C6（二）手性碳原子：旋光性（二）手性碳原子：旋光性 结构特点与性质结构特点与性质阿莫西林阿莫西林（二）手性碳原子：旋光性（二）手性碳原子：旋光性 结构特点与性质结构特点与性质头孢克洛头孢克洛头孢菌素类头孢菌素类青霉素类青霉素类（三）共轭体系：（三）共轭体系：

22、UVUV 结构特点与性质结构特点与性质母核无吸收；母核无吸收；苯环取代基有苯环取代基有UVUV母核、苯环取代母核、苯环取代基均有基均有UVUV青霉素钠青霉素钠UV7-20头孢菌素类头孢菌素类青霉素类青霉素类（四）（四） - -内酰胺环内酰胺环结构特点与性质结构特点与性质四元环张力大四元环张力大 酰胺键易水解酰胺键易水解 水溶液：不稳定水溶液：不稳定 干燥纯净：稳定干燥纯净：稳定 青霉素类青霉素类（某些金属离子）（某些金属离子） （温度）（温度）降解降解失效失效某些氧化剂某些氧化剂酸、碱、青霉素酶酸、碱、青霉素酶青青霉霉素素青霉噻唑酸青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉素酶青霉酸青霉酸H2OpH2

23、100青霉噻唑酰基青霉噻唑酰基羟胺酸羟胺酸NH2OH青霉烯酸青霉烯酸pH4青霉胺青霉胺CO2青霉醛青霉醛HgCl2头孢菌素类头孢菌素类酸、碱、胺类酸、碱、胺类 -内酰胺酶内酰胺酶降解降解失效失效1、TLC法法2、HPLC法法二、鉴别试验二、鉴别试验（一）色谱法：（一）色谱法：对照品对照法对照品对照法1、IR法法鉴别试验鉴别试验（二）光谱法（二）光谱法2、UV法法鉴别试验鉴别试验（二）光谱法（二）光谱法Cu2+头孢唑啉钠头孢唑啉钠 max = 272nm2、 UV法法（1）样品的最大吸收波长）样品的最大吸收波长Cu2+头孢氨苄头孢氨苄 max = 262nm青霉素青霉素V钠钠 A280nm/A2

24、64nm = 1.301.50（2）分解产物的最大吸收波长）分解产物的最大吸收波长2、类似肽键的反应、类似肽键的反应鉴别试验鉴别试验（三）呈色反应：（三）呈色反应：酚羟基酚羟基3、其他呈色反应、其他呈色反应1、羟肟酸铁反应、羟肟酸铁反应羟肟酸铁反应羟肟酸铁反应鉴别试验鉴别试验（三）呈色反应（三）呈色反应鉴别试验鉴别试验（四）各种盐的反应（四）各种盐的反应 焰色焰色鲜黄色鲜黄色 + 醋酸氧铀锌醋酸氧铀锌黄黄 Na+ 焰色焰色紫色紫色 + 0.1%四苯硼钠四苯硼钠 + Ac白白 K+1.聚合物：聚合物：分子排阻色谱法分子排阻色谱法2.有关物质和异构体：有关物质和异构体：色谱法色谱法3.杂质含量：杂

25、质含量：吸光度吸光度4.有机溶剂：有机溶剂： GC法法5.结晶性：结晶性： 三、检查三、检查四、含量测定四、含量测定链霉素链霉素 双氢链霉素双氢链霉素新霉素新霉素 卡那霉素卡那霉素庆大霉素庆大霉素 巴龙霉素巴龙霉素第三节第三节氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素一、结构分析与代表药物一、结构分析与代表药物链霉双糖胺链霉双糖胺链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺链霉素链霉素D-葡萄糖胺葡萄糖胺+脱氧链霉胺脱氧链霉胺+D-核糖核糖+巴龙霉糖巴龙霉糖巴龙胺巴龙胺巴巴龙二糖胺龙二糖胺巴龙霉素巴龙霉素巴龙霉素巴龙霉素 巴龙霉素巴龙霉素I R1=CH2NH2 R2=H 巴龙霉素巴龙霉素I

26、I R1=H R2=CH2NH2 绛红糖胺绛红糖胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺庆大霉素庆大霉素庆大霉素庆大霉素 庆大霉素庆大霉素C1 R=H R1=R2=CH3 庆大霉素庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素庆大霉素C1a R=R1=R2=H 庆大霉素庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺链霉素链霉素巴龙霉素巴龙霉素 巴龙霉素巴龙霉素I R1=CH2NH2 R2=H 巴龙霉素巴龙霉素II R1=H R2=CH2NH2 绛红糖胺绛红糖胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺庆大霉素庆大霉素多与硫酸成盐多与

27、硫酸成盐链霉素链霉素 3 3个个庆大霉素庆大霉素 5 5个个碱性中心碱性中心（一）碱性（一）碱性水溶性水溶性（二）溶解性（二）溶解性巴龙霉素巴龙霉素 4 4个个二、二、结构与性质结构与性质链霉素链霉素 pH5.07.5庆大霉素庆大霉素 pH2.012.0 稳定稳定（三三）稳定性稳定性结构与性质结构与性质（四四）UV链霉素：链霉素：230nm（五五）旋光性旋光性硫酸庆大霉素：硫酸庆大霉素：+107至至 +121硫酸巴龙霉素：硫酸巴龙霉素：+50至至 +55（右旋）（右旋）结构与性质结构与性质三、三、鉴别试验鉴别试验坂口反应坂口反应麦芽酚反应麦芽酚反应N-甲基葡萄甲基葡萄糖胺反应糖胺反应链霉胍特有

28、反应链霉胍特有反应链霉糖特有反应链霉糖特有反应羟基胺结构羟基胺结构（一）茚三酮反应（一）茚三酮反应鉴别试验鉴别试验（二）（二）Molisch反应反应氨基糖苷类氨基糖苷类抗生素抗生素糠醛或糠醛或羟甲基糠醛羟甲基糠醛H+-萘酚萘酚 或或 蒽酮蒽酮呈色呈色鉴别试验鉴别试验具五碳糖或六碳糖结构的氨基糖苷类经具五碳糖或六碳糖结构的氨基糖苷类经酸水解后，在酸作用下脱水生成糠醛酸水解后，在酸作用下脱水生成糠醛（五碳糖）或甲基糠醛，这些产物遇（五碳糖）或甲基糠醛，这些产物遇-萘酚萘酚或蒽酮呈色。或蒽酮呈色。-萘酚呈色萘酚呈色红紫色红紫色蒽酮呈色蒽酮呈色蓝紫色蓝紫色（三）（三） N-N-甲基葡萄糖胺反应甲基葡萄

29、糖胺反应乙酰丙酮乙酰丙酮 OH-吡咯衍生物吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛 H+樱桃红色樱桃红色（Elson-Morgan反应）反应）氨基糖苷类氨基糖苷类抗生素抗生素葡萄糖胺衍生物葡萄糖胺衍生物鉴别试验鉴别试验（四四）麦芽酚反应麦芽酚反应 链霉素特征反应链霉素特征反应H+分子重排分子重排鉴别试验鉴别试验麦芽酚麦芽酚链霉胍特有反应链霉胍特有反应（五）坂口反应（五）坂口反应（或或-萘酚萘酚）鉴别试验鉴别试验H+（六）硫酸盐反应（六）硫酸盐反应（七）色谱法（七）色谱法1、TLC法：法：2、HPLC法法鉴别试验鉴别试验（一）有关物质检查（一）有关物质检查链霉素链霉素B B（甘露糖链霉素）（甘

30、露糖链霉素）2. 方法方法 TLCTLC中的对照品法中的对照品法1. 来源来源 发酵产物发酵产物四、四、有关物质及组分分析有关物质及组分分析（二）组分测定（二）组分测定有关物质及组分分析有关物质及组分分析对微生物的活性无明显差异对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同发酵菌种不同工艺差别工艺差别C C组分比例组分比例不一致不一致规定控制各组分的相对百分含量规定控制各组分的相对百分含量方法方法 1.2、计算：峰面积归一化法、计算：峰面积归一化法1、测定：、测定：HPLC 有关物质及组分分析有关物质及组分分析蒸发光散射、衍生化法蒸发光散射、衍生化法 max =

31、330nm衍生化原理衍生化原理 1 1、2、蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器(ELSD)2005年版药典年版药典ChP2000年版年版 1-烷基硫代烷基硫代-2-烷基烷基异吲哚衍生物异吲哚衍生物方法方法 1.规定规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%ChP2010：蒸发光散射检测蒸发光散射检测有关物质及组分分析有关物质及组分分析固定相：十八烷基硅烷键合硅胶固定相：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：流动相：0.2mol/L三氟醋酸三氟醋酸-甲醇甲醇(92 8)检测器：蒸发光散射检测器检测器：蒸发光散射检测器 方法方法 1.规定规定 C1 2550% C1a 1035%

32、C2a +C2 2555%USP35-NF30：衍生化紫外检测衍生化紫外检测有关物质及组分分析有关物质及组分分析固定相：十八烷基硅烷键合硅胶固定相：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：流动相：0.7%1-庚烷磺酸钠甲醇庚烷磺酸钠甲醇-水水-冰醋酸冰醋酸 (70:25:5)检测器：紫外检测器（检测器：紫外检测器（330nm） 方法方法 1.规定规定 C1 2040% C1a 1030% C2b + C2a +C2 4060%BP2010：柱后衍生化电化学检测柱后衍生化电化学检测有关物质及组分分析有关物质及组分分析固定相：苯乙烯固定相：苯乙烯-二乙烯苯共聚物二乙烯苯共聚物 流动相：流动相：无二氧化碳的水配

33、制备的无二氧化碳的水配制备的60g/L无水硫酸无水硫酸 钠，钠，1.75g/L 1-辛基磺酸钠，辛基磺酸钠，8ml/L四氢呋四氢呋 喃，喃，50 ml/L 0.2mol/LM磷酸二氢钾磷酸二氢钾,pH3.0 检测器：脉冲安培检测器检测器：脉冲安培检测器 微生物检定法微生物检定法HPLC法法五、五、含量测定含量测定SizeofCylinderCupT2S1S2T1管碟法ABCD第四节第四节四环素类抗生素四环素类抗生素一、结构分析与代表药物一、结构分析与代表药物123456789101112第四节第四节四环素类抗生素四环素类抗生素四环素类代表药物四环素类代表药物四环素（四环素（TC）tetracy

34、cline金霉素金霉素 (CTC)氯四环素；氯四环素；chlortetracycline四环素类代表药物四环素类代表药物土霉素土霉素 (OTC)氧四环素氧四环素oxytetracycline四环素类代表药物四环素类代表药物多西环素多西环素 (DOXC)脱氧土霉素；脱氧土霉素；doxycycline四环素类代表药物四环素类代表药物美他环素美他环素（METC） metacycline四环素类代表药物四环素类代表药物二、二、结构与性质结构与性质（一）两性（一）两性1、与酸、碱均能成盐、与酸、碱均能成盐2、强酸或强碱中溶解度、强酸或强碱中溶解度 酚羟基、烯醇型羟基酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性弱酸性二甲胺

35、基二甲胺基 弱碱性弱碱性结构与性质结构与性质（二）旋光性（二）旋光性结构与性质结构与性质盐酸土霉素：盐酸土霉素： -188 -200 盐酸四环素：盐酸四环素： -240 -258 盐酸多西环素：盐酸多西环素：-105 -120 （三）紫外吸收（三）紫外吸收结构与性质结构与性质 盐酸多西环素盐酸多西环素: 269; 353nm (max) 234; 296nm (min )盐酸美他环素：盐酸美他环素： 345; 282; 353nm(max) 264; 222nm(min) 盐酸金霉素盐酸金霉素（四）荧光吸收（四）荧光吸收结构与性质结构与性质绿色绿色绿色绿色盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸四环素盐酸四环

36、素蓝色蓝色蓝色蓝色黄色黄色（五）不稳定性（五）不稳定性结构与性质结构与性质四环素类四环素类差向异构化差向异构化酸性降解酸性降解碱性降解碱性降解（五）不稳定性（五）不稳定性1、差向异构化、差向异构化4-4-差向金霉素差向金霉素4-4-差向四环素差向四环素金霉素金霉素四环素四环素6 62 2pH淡黄淡黄黑黑蓝色荧光蓝色荧光结构与性质结构与性质土霉素土霉素 美他环素美他环素（五）不稳定性（五）不稳定性2、酸性降解、酸性降解脱水金霉素脱水金霉素脱水四环素脱水四环素金霉素金霉素四环素四环素pH2445 nm435 nm结构与性质结构与性质四环素四环素脱水四环素脱水四环素差向脱水四环素差向脱水四环素（五）

37、不稳定性（五）不稳定性3、碱性降解、碱性降解结构与性质结构与性质异四环素异四环素四环素四环素OH-（二二）TLC法法盐酸土霉素的鉴别盐酸土霉素的鉴别EDTAEDTA 克服痕量金属造成的克服痕量金属造成的 拖尾现象拖尾现象（一一） HPLC法法三、三、鉴别试验鉴别试验（四四）UV法法（三三）IR光谱光谱法法鉴别试验鉴别试验紫红紫红 黄黄蓝蓝 绿绿朱红色朱红色黄色黄色橙红色橙红色盐酸四环素盐酸四环素盐酸金霉素盐酸金霉素盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸多西环素盐酸多西环素盐酸美他环素盐酸美他环素鉴别试验鉴别试验（五）浓（五）浓H2SO4反应反应H2SO4（六）（六）FeCl3反应反应鉴别试验鉴别试验盐酸四环

38、素盐酸四环素盐酸金霉素盐酸金霉素盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸多西环素盐酸多西环素FeCl3红棕色红棕色深褐色深褐色橙褐色橙褐色褐色褐色 4-差向四环素（差向四环素（ETC） 脱水四环素（脱水四环素（ATC） 差向脱水四环素（差向脱水四环素（EATC） 盐酸金霉素（盐酸金霉素（CTC）（一一）有关物质有关物质四、四、杂质检查杂质检查特殊杂质检查特殊杂质检查 4-差向四环素（差向四环素（ETC）；）；盐酸金霉素盐酸金霉素(CTC) 脱水四环素（脱水四环素（ATC）;差向脱水四环素（差向脱水四环素（EATC) 分别不得过分别不得过:4.0%, 0.5%, 0.5%, 1.0%吸收系数比为吸收系数比为:0

39、.87, 0.86, 2.2, 2.0 1、有关物质、有关物质TLC法（法（1995版）版）HPLC法（法（2000版、版、2005版版）标准品对照法标准品对照法盐酸四环素盐酸四环素ChP、USP、BP均用HPLC四环素有关物质四环素有关物质TLC图图I. 供试液供试液( 5 mg/ml)II.ETCIII.( 0.2 mg/ml)III. ATCIV.( 0.025 mg/ml)IV. EATC ( 0.025 mg/ml)V.CTCVI. ( 0.1 mg/ml)VI. 混合液混合液40.50.52（二）杂质吸光度（二）杂质吸光度盐酸四环素盐酸四环素A430nm0.5 (ATC; EATC

40、)A530nm0.12 (异四环素异四环素) 杂质检查杂质检查（二）杂质吸光度（二）杂质吸光度取取本本品品，在在20-25时时加加0.8%氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液制制成成每每1ml中中含含10mg的的溶溶液液，照照紫紫外外-可可见见分分光光光光度度法法，置置4cm的的吸吸收收池池中中，自自加加0.8%氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液5分分钟钟时时，在在530nm波波长长处处测测定定，其其吸吸光光度度不不得得过超过超0.12(供注射用供注射用) 。应严格控制温度和时间应严格控制温度和时间杂质检查杂质检查固定相：十八烷基硅烷键合硅胶固定相：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：醋酸铵溶液流动相：醋酸铵溶液-乙腈乙腈(83:17)检测器：检测器：UV（280nm）定量方法：外标法以峰面积计定量方法：外标法以峰面积计。五、五、含量测定含量测定ThankYou!