SNP分子标记的原理及应用解析学习教案

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1、会计学1SNP分子标记的原理及应用分子标记的原理及应用(yngyng)解解析析第一页，共42页。SNP 的概的概念念(ginin) n n单核苷酸多态性单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)SNP)，指由于单个核，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致(yzh)(yzh)而只有而只有一个碱基不同的现

2、象，即一个碱基不同的现象，即SNPSNP。n n它包括单碱基的转换它包括单碱基的转换, ,颠换、颠换、 插入及缺失等形式。插入及缺失等形式。第1页/共41页第二页，共42页。SNP 的特点的特点(tdin) n n（1 1）密度高）密度高SNPSNP在人类基因组的平均密度估计为在人类基因组的平均密度估计为1100011000bp,bp,在整个基因组的分布达在整个基因组的分布达31063106个。个。n n（2 2）富有代表性某些位于基因内部的）富有代表性某些位于基因内部的SNPSNP有可能直接有可能直接影响蛋白质结构或表达水平影响蛋白质结构或表达水平, ,因此因此, ,它们可能代表疾病遗传它们

3、可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。机理中的某些作用因素。n n（3 3）遗传稳定性）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相比与微卫星等重复序列多态性标记相比, ,SNPSNP具有更高的遗传稳定性。具有更高的遗传稳定性。n n（4 4）易实现分析）易实现分析(fnx)(fnx)的自动化的自动化SNPSNP标记在人群中只有标记在人群中只有两种等位型两种等位型(allele)(allele)。这样在检测时只需一个。这样在检测时只需一个“+-”“+-”或或“ “全全 无无” ”的方式的方式, ,这使得基于这使得基于SNPSNP的检测分析的检测分析(fnx)(fnx)方法易实现自方法易实现自动化

4、。动化。 第2页/共41页第三页，共42页。n n种族遗传学种族遗传学n nTangTang等研究了来自世界五个地区等研究了来自世界五个地区( (中国、马来、高加中国、马来、高加索、印度索、印度(ynd)(ynd)和非洲和非洲) )人群的人群的MDR1MDR1基因的单倍体基因的单倍体和连锁不平衡特征和连锁不平衡特征, ,发现具有发现具有e12/1236T2e21/e12/1236T2e21/2677T2e26/3435T2677T2e26/3435T亚型的单倍型亚型的单倍型mh5mh5在非洲人群以外在非洲人群以外的四种人群中高度表达的四种人群中高度表达, ,而具有而具有e12/1236C2e2

5、1/e12/1236C2e21/2677G2e26/3435C2677G2e26/3435C亚型的单倍型亚型的单倍型mh7mh7在非洲人群中占在非洲人群中占了了1/31/3以上以上, ,进一步证明了种族间的表形差异。进一步证明了种族间的表形差异。SNP SNP SNP 的的的的的的应应应应应应用用用用用用(yngyng) (yngyng) (yngyng) 第3页/共41页第四页，共42页。n n疾病易感性研究疾病易感性研究n n原原理理：SNPsSNPs被被认认为为是是一一种种稳稳定定遗遗传传的的早早期期突突变变, ,与与疾疾病病有有着着稳稳定定的的相相关关性性。当当一一个个遗遗传传标标记记

6、的的频频率率在在患患者者明明显显超超过过非非患患者者时时, ,即即表表明明该该标标记记与与疾疾病病关关联联, ,通通过过比比较较分分析析两两者者的的单单倍倍型型和和研研究究连连锁锁(lin(linsu)su)不不平平衡衡性性, ,可可将将基基因因组组中中任任何何未知的致病基因定位。未知的致病基因定位。n nHorikawaHorikawa 等等应应用用SNPsSNPs作作为为遗遗传传标标记记通通过过基基于于连连锁锁(lin(linsu)su)不不平平衡衡的的相相关关分分析析, ,在在墨墨西西哥哥裔裔美美国国人人群群和和北北欧欧人人群群中中发发现现了了一一个个DMDM易易感感基基因因, ,该该基

7、基因因第第三三个个内内含含子子上上的的A/A/G G多多态态性性(SNP43)(SNP43)同同2 2型型糖糖尿尿病病(2(2型型DM)DM)连连锁锁(lin(linsu),su),该该位位点点为为纯纯合合子子G G的的个个体体患患2 2型型DMDM的的风风险险增增加加, ,这这是是目目前前为为止止所所发发现现的的第第一一个个与与2 2型型DMDM相相关关的的SNPSNP, ,预预示示了了SNPSNP在在DMDM相相关关基基因研究中的重要作用。因研究中的重要作用。第4页/共41页第五页，共42页。n n药物基因组学研究药物基因组学研究n nSNPsSNPs可可以以精精细细地地反反映映个个体体的

8、的遗遗传传差差异异,SNPs,SNPs位位点点与与个个体体的的药药物物反反应应进进行行相相关关分分析析, ,从从而而确确定定基基因因在在药药物物作作用用中中的的功功能能和和意意义义。这这样样既既可可以以根根据据患患者者的的遗遗传传特特性性设设计计治治疗疗方方案案, ,实实现现“ “个个性性化化治治疗疗”, ”,提提高高药药效效，降降低低药药物物的的毒毒副副作作用用, ,又又可可以以在在临临床床试试验验阶阶段段为为特特定定的的药药物选择合适物选择合适(hsh)(hsh)的受试者的受试者, ,提高效率提高效率, ,减少费用。减少费用。第5页/共41页第六页，共42页。n n遗传育种的应用遗传育种的

9、应用n n检测水稻检测水稻SNPSNP，研究，研究(ynji)(ynji)优良性状与优良性状与SNPsSNPs的关联关系，的关联关系，指导育种。指导育种。第6页/共41页第七页，共42页。SNP的检测的检测(jin c)方法方法n n基于以下基于以下9 9种基本原理种基本原理: :n n以结构以结构(jigu)(jigu)为基础为基础; ;n n1.11.1限制性片段长度多态性法限制性片段长度多态性法 （RFLPRFLP）; ;n n1.21.2单链构象多态性法单链构象多态性法 （SSCPSSCP）; ;n n1.31.3变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳 （DGGEDGGE）; ;n n 等位

10、基因特异等位基因特异PCRPCR（AS-PCRAS-PCR）; ;n nRT-PCR;RT-PCR;n n 等位基因特异性杂交等位基因特异性杂交; ;n n 引物延伸法引物延伸法- -单碱基延伸法单碱基延伸法; ;n nDNADNA直接测序法直接测序法; ;n n 飞行质谱仪飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)(MALDI-TOFMS)检测检测; ;n n 变性高效液相色谱变性高效液相色谱(DHPLC)(DHPLC)法；法；第7页/共41页第八页，共42页。1.1 RFLP法法原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切

11、片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果(jigu)就可以判断是否SNP位点。第8页/共41页第九页，共42页。1.2 单链构象单链构象(u xin)多态性多态性(SSCP)原原理理：单单链链DNADNA在在中中性性条条件件下下会会形形成成二二级级结结构构，不不同同的的二二级级结结构构在在电电泳泳中中会会出出现现不不同同的的迁迁移移率率。这这种种二二级级结结构构依依赖赖于于碱碱基基的的组组成成，单单个个碱碱基基的的改改变变也也会会影影响响其其构构象象，最最终终会会导导致致在在凝凝胶上迁移速度的改变。胶上迁移速度的改变。 在在非非变变性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶上上，短短的的单单链链 D

12、NADNA和和RNARNA分分子子依依其其单单碱碱基基序序列列的的不不同同而而形形成成不不同同的的构构象象，这这样样在在凝凝胶胶上上的的迁迁移速率不同，出现不同的条带，检测移速率不同，出现不同的条带，检测SNPSNP。特特点点：由由于于该该方方法法简简单单快快速速，因因而而(yn(ynr)r)被被广广泛泛运运用用于于未未知知基基因因突突变变的的检检测测。这这种种方方法法的的弊弊端端在在于于不不能能确确定定突突变变类类型型和和具具体位置。体位置。第9页/共41页第十页，共42页。1.3 变性变性(binxng)梯度凝梯度凝胶电泳（胶电泳（DGGE）n n原原理理：是是利利用用长长度度相相同同(x

13、in(xintn)tn)的的双双链链 DNADNA片片段段解解链链温温度度不不同同的的原原理理, ,通通过过梯梯度度变变性性胶胶将将 DNADNA片片段分开的电泳技术。段分开的电泳技术。第10页/共41页第十一页，共42页。2. 2. 等位基因特异等位基因特异等位基因特异等位基因特异(ty) PCR ( AS-PCR)(ty) PCR ( AS-PCR)原原理理：根根据据 SNPSNP位位点点设设计计特特异异引引物物, ,其其中中一一条条链链( (特特异异链链) )的的3 3末末端端与与 SNPSNP位位点点的的碱碱基基互互补补(h(hb)(b)(或或相相同同) ), ,另另一一条条链链( (

14、普普通通链链) )按按常常规规方方法法进进行行设设计计, ,因因此此,AS-PCR,AS-PCR技技术术是是一一种种基基于于SNPSNP的的PCRPCR标标记记。因因为为特特异异引引物物在在一一种种基基因因型型中中有有扩扩增增产产物物, ,在在另另一一种种基基因因型型中中没没有有扩扩增增产产物物, ,用用凝凝胶胶电电泳泳就就能能够够很很容容易易地地分分辨辨出出扩扩增增产产物物的的有有无无, ,从从而而确确定定基基因因型型的的 SNPSNP。第11页/共41页第十二页，共42页。3. RT-PCRn n实时荧光(ynggung)PCR 技术(RT-PCR)一种通过检测PCR过程中和 PCR之 后

15、 产 生 的 荧 光(ynggung)信号来区分等位基因类型的SNP检测技术,同时基于荧光 (ynggung)能 量 转 移 原 理 (FRET)。每检测一个SNP位点需要一条探针,其3端连有淬灭剂基团,5端连有荧光(ynggung)剂基团,最终与SNP位点完全匹配时探针结构 被 破 坏 , 从 而 发 出 荧 光(ynggung)而被检测。第12页/共41页第十三页，共42页。第13页/共41页第十四页，共42页。v定量分析定量分析(dnglingfnx)v高灵敏高灵敏vTaqMan Gene Expression Master Mix 定性分析(dngxngfnx)高特异性TaqMan G

16、enotyping Master MixABNew Master Mix第14页/共41页第十五页，共42页。4. 等位基因特异性等位基因特异性杂交杂交(zjio)n n等 位 基 因 特 异 性 杂 (Allelespecifichybridization,ASH)n n根据(gnj)核苷酸探针和互补的目的片段进行杂交，完全匹配和有错配两种情况下杂交复合体稳定性的不同而将SNP位点检测出来。n n等位基因特异核苷酸片段分析(ASO)，基因芯片和动态等位基因特异性杂交(DASH)等。第15页/共41页第十六页，共42页。第16页/共41页第十七页，共42页。5.引物延伸引物延伸(ynshn)法

17、法-单单碱基延伸碱基延伸(ynshn)法法第17页/共41页第十八页，共42页。单重单重SNaPshot数数据据(shj)第18页/共41页第十九页，共42页。多重多重SNaPshot反反应应(fnyng)原理原理第19页/共41页第二十页，共42页。SNaPshot操作操作(cozu)流程流程第20页/共41页第二十一页，共42页。SNaPshotMultiplex试剂盒试剂盒n nSNaPshotMultiplex Ready Reaction MixSNaPshotMultiplex Ready Reaction Mixn n一管一管(y (y u u n)n)做做1010个位点个位点n

18、 n对照对照: 30: 30个反应个反应n n6 6条对照引物条对照引物: 20A, 28G/A, 36G, 44T, 52C/T, 60C: 20A, 28G/A, 36G, 44T, 52C/T, 60Cn n对照模板对照模板DNA: Ampliconfrom CEPH DNADNA: Ampliconfrom CEPH DNAn n0.01 0.4 pmol0.01 0.4 pmol纯化的纯化的PCRPCR模板模板n nMatrix Standard DS-02Matrix Standard DS-02n ndR110, dR6G, dTAMRA, dROX, LIZdR110, dR6

19、G, dTAMRA, dROX, LIZ第21页/共41页第二十二页，共42页。质粒SNaPshot PCR纯化(chn hu)电泳(din yn)样本制备电泳(din yn)PCR产物纯化软件分析第22页/共41页第二十三页，共42页。SNaPshot PCR第23页/共41页第二十四页，共42页。SNaPshot PCR产产物物(chnw)纯化纯化Sealplate&incubate乙醇沉淀法乙醇沉淀法: 11 个步骤, 1 小时AddreagentsCentrifugeEmptyplateAddreagentsSealplate&incubateAnalyzeRe-suspendDryC

20、entrifugeEmptyplateSealplate第24页/共41页第二十五页，共42页。加样震荡30分钟分析离心封口BigDye XTerminator Purification Kit第25页/共41页第二十六页，共42页。6.DNA测序法测序法n n直接测序是最容易实施的SNP检测方法。n n原理:通过(tnggu)对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率可达100%。n n特点：可以得到SNP的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。第26页/共41页第二十七页，共42页。第27页/共41页第二十八页，共42页。7.飞行飞行(fi

21、xng)质谱仪质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测检测 原原理理：是是将将变变性性的的单单链链PCRPCR产产物物通通过过与与硅硅芯芯片片上上的的化化合合物物共共价价结结合合后后, ,在在硅硅芯芯片片上上进进行行引引物物的的退退火火, ,延延伸伸反反应应(fnyng),(fnyng),突突变变部部位位配配对对的的碱碱基基与与正正常常配配对对的的碱碱基基不不相相同同。根根据据引引物物在在延延伸伸反反应应(fnyng)(fnyng)中中所所结结合合的的不不同同碱碱基基的的不不同同质质量量在在质质谱谱仪仪上上显显示示不不同同峰而检测峰而检测SNPSNP。第28页/共41页第二十九页，共42页。

22、n nSNPSNP分分型型的的方方法法多多种种多多样样，MassARRAYMassARRAY分分子子量量阵阵列列技技术术是是SequenomSequenom公公司司推推出出的的世世界界上上领领先先的的基基因因分分析析工工具具，通通过过引引物物延延伸伸或或切切割割反反应应(fnyng)(fnyng)与与灵灵敏敏、可可靠靠的的MALDITOFMALDITOF质质谱谱技技术术相相结合，实现基因分型检测。结合，实现基因分型检测。n n基基于于MassARRAYMassARRAY分分子子量量阵阵列列平平台台的的iPLEXiPLEXGOLDGOLD技技术术可可以以设设计计最最高高多多达达4040重重PCR

23、PCR反反应应(fnyng)(fnyng)和和基基因因型型检检测测，实实验验设设计计非非常常灵灵活活，分分型型结结果果准准确确性性高高。特特别别适适合合于于对对全全基基因因组组研研究究发发现现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。第29页/共41页第三十页，共42页。MassARRAY技术(jsh)原理:n n先先通通过过PCRPCR扩扩增增目目标标序序列列，然然后后加加入入SNPSNP序序列列特特异异延延伸伸引引物物，在在SNPSNP位位点点上上，延延伸伸1 1个个碱碱基基，在在反反应应(fnyng)(fnyng)体体

24、系系中中以以ddNTPddNTP替替代代dNTPdNTP，使使探探针针仅仅在在SNPSNP位位点点处处延延伸伸一一个个碱碱基基即即终终止止。根根据据SNPSNP位位点点的不同，探针将结合不同的的不同，探针将结合不同的ddNTPddNTP，从而具有不同的分子量。，从而具有不同的分子量。n n将将制制备备的的样样品品分分析析物物与与芯芯片片基基质质共共结结晶晶后后在在质质谱谱仪仪的的真真空空管管经经强强激激光光激激发发，核核酸酸分分子子解解吸吸附附为为单单电电荷荷离离子子，电电场场中中离离子子飞飞行行时时间间与与离离子子质质量量成成反反比比，通通过过检检测测核核酸酸分分子子在在真真空空管管中中的的

25、飞飞行行时时间间而而获获得得样样品分析物的精确分子量，从而检测出品分析物的精确分子量，从而检测出SNPSNP位点信息。位点信息。第30页/共41页第三十一页，共42页。第31页/共41页第三十二页，共42页。第32页/共41页第三十三页，共42页。第33页/共41页第三十四页，共42页。第34页/共41页第三十五页，共42页。第35页/共41页第三十六页，共42页。第36页/共41页第三十七页，共42页。优势优势(yush)n n（1 1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一分子量，不涉及荧光标记、分子量，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准

26、确性高，机器本身出错的概率凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低；非常低；n n（2 2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmolpmol级别的物质都能被检级别的物质都能被检测出来；测出来；n n（3 3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔；）通量高：几秒就能检测完一个反应孔；n n（4 4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCRPCR仪器；仪器；n n（5 5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应；）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应；n n（6 6）便

27、宜：引物不带荧光标记，普通长度（）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3 3条引物总长条引物总长80bp80bp左右），此外左右），此外在一个反应孔内能完成在一个反应孔内能完成4 4个或更多的反应，即通常所说的个或更多的反应，即通常所说的4 4重反应；重反应；n n（7 7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及(y (y j) j)蛋白质组学、蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。微生物鉴定等领域也能应用。n n（8 8）质谱技术是）质谱技术是“ “一管式操作一管式操作” ”，即反应体系在生化学实验过程中始终在，即反应体系在生化学实验过程中始终在

28、一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。第37页/共41页第三十八页，共42页。8.变性变性(binxng)高效液相色谱高效液相色谱( DHPLC)vv原原理理：目目标标核核酸酸片片段段PCRPCR扩扩增增，部部分分加加热热(ji(jir)r)变变性性后后，含含有有突突变变碱碱基基的的DNADNA序序列列由由于于错错配配碱碱基基与与正正常常碱碱基基不不能能配配对对而而形形成成异异源源双双链链。因因包包含含错错配配碱碱基基的的杂杂合合异异源源双双链链区区比比完完全全配配对对的的同同源源配配对对区区和和固固定定相相的的亲亲和和力力

29、弱弱，更更易易被被从从分分离离柱柱上上洗洗脱脱下下来来, ,从从而而达达到到分分离离的的目目的的。SNPsSNPs的的有有无无最最终终表表现现为为色色谱谱峰峰的的峰峰形形或或数数目目差差异异, ,依依据据此此现现象象可可很很容容易从色谱图中判断出突变的碱基。易从色谱图中判断出突变的碱基。vv特特点点：使使用用高高效效液液相相色色谱谱检检测测SNPsSNPs具具有有检检测测效效率率高高，便便于于自自动动化化的的优优点点，对对未未知知SNPsSNPs的的准准确确率率可可达达95%95%以以上上。但但DHPLCDHPLC检检测测对对所所用用试试剂剂和和环环境境要要求较高求较高, ,容易产生误差容易产

30、生误差, ,不能检测出纯合突变。不能检测出纯合突变。第38页/共41页第三十九页，共42页。第39页/共41页第四十页，共42页。第40页/共41页第四十一页，共42页。内容(nirng)总结会计学。它包括单碱基的转换, 颠换、 插入及缺失等形式。原理：SNPs 被认为是一种稳定遗传(ychun)的早期突变,与疾病有着稳定的相关性。等位基因特异PCR（AS-PCR）。根据核苷酸探针和互补的目的片段进行杂交，完全匹配和有错配两种情况下杂交复合体稳定性的不同而将SNP 位点检测出来。（5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应。（7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用第四十二页，共42页。