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1、 实时定量实时定量PCR技术技术 目录目录实时定量实时定量PCRPCR基本原理基本原理实时定量实时定量PCRPCR实验材料实验材料实时定量实时定量PCRPCR实验方法实验方法实时定量实时定量PCRPCR实验结果实验结果实时定量实时定量PCR基本原理基本原理1实时定量PCR的定义2实时定量PCR标准曲线定量定量PCR技术：利用技术：利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，最终精，最终精确的对确的对起始模板起始模板的定量分析的定量分析实时定量PCR的定义定量定量PCR三个基本概念三个基本概念扩增曲线扩增曲
2、线指数增长期 平台期线性增长期背景期阈值与阈值与C(t)值值阈值：阈值：是循环开始是循环开始315个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010倍，设定在倍，设定在扩增曲线扩增曲线指数增长期C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04C(t) value18.12 +/- 0.04C(t) value18.12 +/-
3、0.04定量定量PCR的数学原理的数学原理理想的理想的PCRPCR反应：反应：X Xn n=X=X0 02 2n n非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：X Xn n=X=X0 0(1+Ex)(1+Ex)n n方程式两方程式两边同同时取取对数得数得: : log Xn=log (X0 (1+Ex)n)整理方程式得整理方程式得: :log X0= (- log(1+Ex) )n+ log Xn将将C(t)C(t)和达到和达到C(t)C(t)值时终产物的量值时终产物的量Xc(t)带入上式得：带入上式得：log X0= (- log(1+Ex) ) C(t)+ log Xc(t) 初始浓度的对数与
4、循环数呈线性关系初始浓度的对数与循环数呈线性关系n n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数X Xn n：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量X X0 0：初始模板量：初始模板量ExEx：扩增效率：扩增效率荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210初始模板量越多，初始模板量越多，C(t)C(t)值越小值越小C(t)C(t)与初始与初始模板浓度的对数值成线性关系模板浓度的对数值成线性关系实时定量PCR标准曲线定量原理定量原理浓度的对数值浓度的对数值与与循环数循环数呈呈线性关系，根据样品扩增线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（达到域值的循环数（Ct值）值）就可分析样品中起始模板就可分析样品中起始模板量量定量定量PCR的的实验步步骤1 1标准菌株标准菌株DNADNA的提取的提取2 2QPCRQPCR探针和引物的设计探针和引物的设计3 3阳性克隆质粒的构建阳性克隆质粒的构建4 4荧光定量荧光定量PCRPCR反应反应5 5定量标准曲线定量标准曲线6 6重复性实验重复性实验7 7灵敏性实验灵敏性实验实验材料
