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1、现代生物科技专题现代生物科技专题现代生物科技专题现代生物科技专题1.2基因工程的基本操操 作作 程程 序序v目的基因的获取v基因表达载体的构建v将目的基因导入受体细胞v目的基因的表达和检测基因工程的基本操作程序2 2 2 2、从、从、从、从基因文库基因文库基因文库基因文库中获取中获取中获取中获取( ( ( (基因序列基因序列基因序列基因序列未未未未知知知知) ) ) )基因文库基因文库基因组文库基因组文库部分基因文库如：部分基因文库如：cDNAcDNA文库文库文库文库v目的基因的获取2 2 2 2、利用、利用、利用、利用PCRPCRPCRPCR技术技术技术技术扩增扩增扩增扩增目的基因目的基因目
2、的基因目的基因聚合酶链式反应聚合酶链式反应v目的基因的获取5 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /G GA AC CC C5 5/ /3 3/ /5 5/ /3 3/ /5 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /G GA AC CC C5 5/ /3 3/ /引物引物G GG G高温高温变性变性低温低温复性复性中温中温延伸延伸5 5/ /3 3/ /A AG G引物引物5 5/ /3 3/ /5 5/ /3 3/ /90-9555-6570-75过程过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA
3、模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、复性、复性（55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCR扩增仪扩增仪 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即
4、方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引引物物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已要有一段已知核苷酸序列的目知核苷酸序列的目的的基因基因P PC CR R技技术术获取目的基因的常用方法有哪些获取目的基因的常用方法有哪些? ?（2 2）从基因文库中获取）从基因文库中获取目的基因序列目的基因序列未未知知（3 3）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增目的基因
5、序列目的基因序列已已知知（1 1）人工合成）人工合成-目的基因不是很大且目的基因不是很大且已知已知序列序列v目的基因的获取 科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子启动子( (抗抗虫基因首端虫基因首端) )，导入棉花受精卵，长成的棉花植株，导入棉花受精卵，长成的棉花
6、植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入因的质粒中插入终止子终止子( (抗虫基因末端抗虫基因末端) )，导入棉花，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资资 料料:基因表达载体的构建基因表达载体的构建作为基因表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？作为基因表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？为什么？ v基因表达载体基因表达载体的构建 基因表达基因表达载体的构建是基因工程的核载体的构建是基因工程的核心，其目的是心，其目的是使使目的基因目的基因在受体细胞中在受体细胞
7、中稳定存在稳定存在，并且，并且可以遗传可以遗传给下一代，同给下一代，同时使目的基因能够时使目的基因能够表达和发挥作用表达和发挥作用。v基因表达载体基因表达载体的构建基因表达载体基因表达载体的模式图的模式图的模式图的模式图抗生素抗生素抗生素抗生素抗性抗性抗性抗性基因基因基因基因uu基因表达除含有基因表达除含有基因表达除含有基因表达除含有目的基因目的基因目的基因目的基因外，还需外，还需外，还需外，还需要哪些元件：要哪些元件：要哪些元件：要哪些元件：启动子启动子启动子启动子终止子终止子终止子终止子标记基因标记基因标记基因标记基因细胞的基因结构细胞的基因结构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编
8、码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点RNA聚合酶是一种聚合酶是一种蛋白蛋白质质，能，能识别并与调控序识别并与调控序列列中的中的结合位点结合结合位点结合，能能催化催化DNA转录为转录为RNA启动子终止子启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，能终片断，能
9、终止止DNADNA的转录的转录起始密码子？终止密码子？起始密码子？终止密码子？细胞的基因结构细胞的基因结构与与RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶A G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CA G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C GRNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶启动子终止子成熟成熟mRNA反转录反转录反转录法合成目的基因反转录法合成目的基因cDNAcDNAcDNA不含非编码区的启动子、终止子
10、不含非编码区的启动子、终止子 不含编码区的内含子不含编码区的内含子基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的构建基因表达载体的构建a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因e、复制原点复制原点基因的运载体、目的基因、启动子、终止子和基因的运载体、目的基因、启动子、终止子和标记基因标记基因 等都是等都是DNA片断，如何将它们连接起来？片断，如何将
11、它们连接起来？质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA连接酶连接酶重组重组DNA质粒质粒DNADNA分子分子一个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。上是不同来源的基因重组的过程。基因表达载体的构建基因表达载体的构建质粒中插入启动子、终止子和标记基因质粒中插入启动子、终止子和标记基因 等等 DNA片断，也是同样的重组方法片断，也是同样的重组方法v将目的基因
12、导入受体细胞 转化 目的基因进入目的基因进入受体细胞受体细胞内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持稳定稳定和和表达表达的过程的过程。v将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射技术显微注射技术感受态法感受态法受体受体细胞细胞植物植物植物植物细胞细胞细胞细胞动物动物动物动物细胞细胞细胞细胞原核原核原核原核细胞细胞细胞细胞农杆菌转化法适用于适用于适用于适用于双子叶植物双子叶植物双子叶植物双子叶植物裸子植物裸子植物裸子植物裸子植物适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物基因枪法基因枪法胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子
13、房雄蕊雌蕊花粉管通道法花粉管通道法适用于适用于适用于适用于被子植物被子植物被子植物被子植物 将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序： 目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精）取卵（受精） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物 将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法： 用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子 1、基因
14、工程中科学家常采用细菌、酵母菌等、基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是微生物作为受体细胞，原因是( )A结构简单，操作方便结构简单，操作方便B繁殖速度快繁殖速度快C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单D性状稳定性状稳定,变异少变异少Bv目的基因的表达和检测接种实验接种实验接种实验接种实验抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法DNA-RNADNA-RNA分子杂交法分子杂交法分子杂交法分子杂交法DNADNA分子杂交法分子杂交法分子杂交法分子杂交法受体是否具有受体是否具有受体是否具有受体是否具有转基因特征转基因特征转基因特征转基因特征个体个体个体个体水
15、平水平水平水平目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否导入目的基因是否导入目的基因是否导入目的基因是否导入分子分子分子分子水平水平水平水平方法方法方法方法检测对象检测对象检测对象检测对象DNA分子杂交分子杂交 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形
16、成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 A-A-3232P PT-T-C-G-T-G3232P P-T-T-A-A-C-AX1C-C-A-G-T-T-A-X2-G-G-T-C-A-A-TY1A-A-T-T-C-G-T-Y1-T-T-A-A-G-C-A探针探针探针探针 待测待测待测待测DNAXDNAX 待测待测待测待测DNAYDNAY待测待测DNAY与探针与探针DNA相同相同检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞目的目的目的目的DNADNA片段片段片段片段检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA 用
17、上述用上述探针探针和转基因生物的和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若出现若出现杂交带杂交带, ,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA目的基因蛋白质小鼠体内抗体目的基因受体细胞蛋白质抗原抗原杂交分子检测目的基因是否检测目的基因是否翻译成蛋白质翻译成蛋白质-抗原抗原抗体杂交抗体杂交个体个体生物学水平生物学水平抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等归纳: 基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注农杆菌转化法、显微注射法、射法、感受态法感受态法感受态法感受态法4.4.目目的基因的检测与鉴定的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：
