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1、实验总体安排实验总体安排1大鼠大鼠GAPDH基因的钓取、克隆和鉴定：基因的钓取、克隆和鉴定：大鼠肝细胞总RNA的提取，凝胶电泳检测GAPDH基因的RT-PCR扩增（普通聚合酶）RT-PCR产物的胶回收连接入T载体、转化（GAPDH基因的TA克隆）挑单克隆，摇菌过夜、提质粒酶切鉴定，电泳检测从组织中提取RNA本实验目的：提取大鼠总RNA组织来源：大鼠肝脏。每组做两个样品Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。在酚
2、和氯仿作用下离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，用异丙醇沉淀RNATRIZOL法提取总RNA原理步骤 解剖大鼠肝脏，每个样品取50-100mg组织，立即加入1mlTRIZOL试剂。匀浆。移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。 每1ml TRIZOL中加氯仿0.2ml，摇振15s，置室温23min。 4离心，12,000g15min。 仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。 加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。 4离心，12,000g10min。弃上清，加75乙醇1ml，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4离心，7500g5min。 弃上清，空气干燥5-1
3、0min，加入50l无RNase水重悬沉淀。核酸定量或电泳检测。多余样品-70保存备用。注意事项注意事项抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染，因此操作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理（配制的溶液应尽可能用0.1DEPC在37处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22um滤膜过滤除菌; 所有玻璃器皿均应于使用前180干烤3h或更长时间，塑料器皿可用0.1DEPC浸泡或用氯仿洗涤; 经过DEPC水处理的器皿容器等，最后高温高压灭菌15分钟，以去除残留的DEPC。DEPC水有致癌性，操作时要小心）。注意事项注意事项R
4、Nase广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必戴手套。一旦接触与Rnase相关制品，应更换手套须样品量和Trizol 的加入量一定要按比例，不能随意增加样品量或减少Trizol 量，否则会使内源性RNase 的抑制不完全，导致RNA 降解。 电泳检测琼脂糖凝胶电泳是检测和分离核酸的常用方法琼脂糖琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖浓度。RNA/DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而
5、就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。实验步骤（1） 0.25g 琼脂糖加入25ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（2）冷却到60，加入1l的0.5mg/ml EB，并摇匀。（3）将将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。（4）将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。
6、（5）用移液器吸取总RNA样品5l于封口膜上，再加入1l 的6Xloading buffer，混匀后，小心加入点样孔。(6) 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min。 上样上样预染色的标本预染色的标本预染色的标本预染色的标本注意事项EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样。电泳检测结果：电泳检测结果： RNA提取：提取： 关键关键 防止防止RNARNA降解降解RNA提取的成功与否提取的成功与否是是RT-PCR检测中最检测中最重要的步骤。重要的步骤。RT-PCRRT-PCRRNA的多聚酶反应
7、（的多聚酶反应（RT-PCR）是以）是以mRNA为模板进行逆转录反应（为模板进行逆转录反应（reversetranscription，RT）与）与PCR，可用于检测，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的个拷贝的RNA模板。模板。mRNAcDNAPCR产物产物反转录反转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCR特异性引物, Taq酶Random 6 mers/Oligo dT, 逆转录酶用途用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达,进行基因克隆RNA、缓冲液、缓冲液、dNTP、逆转录酶、逆转录酶、引物（随机引物引物（随机引物/Oligo dT)5AAAAA
8、AAA3TTTTTTTTmRNAcDNA1.逆转录：逆转录：实验步骤按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。 dNTP Mixture（10 mM each） 1 l Oligo dT Primer（2.5 M） 1 l Template RNA5 lRNase Free dH2O 补至总体积 10 l （3l）Template RNA最多可加至8 l，当使用Total RNA时，最多可加至5 g (推荐使用量：100 pg1 g)。在PCR仪上进行变性、退火反应在PCR仪上进行变性、退火反应，程序设置如下： 1）65 5 min. 2）4 NOTE：变性、退火操作有利于模板RNA
9、的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率。注意事项枪的使用；离心；配制RT反应体系离心数秒，使体系集中于管底。在上述管中配制RT反应液RT反应程序在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。 1) 42 15min. 2) 95 5 min 3) 4 2hourAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5 cDNArTaq2.PCR:2.PCR:GAPDHGAPDHGAPDH (sense)GAPDH (antisense)cDNA、缓冲液、缓冲液、dNTP、rTaq、引物、引物（特异引物（特异引物)、Mg2+PCR扩增GAPDH基因编码区：761074，PCR扩增区：57-
10、1114扩增产物PCR扩增：（GAPDH扩增产物1058bp）GAPDH primer:上游引物 5-gcctcgtctcatagacaagatgg-3（57-79） 下游引物5-ctcagtatccttgctgggctg-3（1094-1114） 1058bp实验步骤 建立PCR反应体系： RT获得逆转录反应得到的cDNA 5l 2.0M的GAPDH混合引物 5l 10PCR buffer 5l 10mM dNTPs 2l Taq DNA聚合酶 0.5l ddH2O 33.5l Total volume 50 l按下列程序运行循环： step1 95变性 4 min step2 95变性 4
11、5 sec step3 53复性 45 sec step4 72延伸 90 se step5 72温育 10 min step6 4 保存 24 hrsstep2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。凝胶电泳检测PCR产物在琼脂糖凝胶上一孔加上DNA marker，另外选择孔加入PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳。依据Marker初步检测产物的长度大小和扩增特异性等。必要时做胶回收，以获得高纯度的扩增DNA片段。胶回收-EZNAGel Extraction Kit 实验原理回收柱（硅胶膜）在高盐、低PH值的情况下吸附DNA，在低盐、高PH值的情况下释放DNA。我们知道原理，就知
12、道了影响胶回收的几个影响因素，PH值、高盐试剂、低盐洗脱试剂。 实验步骤1. RT-PCR的产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外灯下观察。为防DNA损伤，避免长时间的紫外光照射。2. 预先准备一称重好的1.5ml离心管，用刀片切下含有所需DNA带的凝胶，置于1.5ml离心管中，称重。3. 往离心管中加入胶重的3倍体积的溶胶液（即每100mg胶加入300 ul 溶胶液）。4. 50水浴10分钟，使凝胶完全熔解，在水浴过程中每23分钟上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。5. 将离心柱放入2ml收集管中，将上一步熔解的凝胶导入离心柱中，12,000rpm离心45秒。弃残液。 6. 将离心柱重新放回收集管
13、；加入600ul 漂洗液，12,000rpm离心1分钟。7. 弃残液，将柱子放回收集管，再600ul 漂洗液，12,000rpm离心1分钟。8.弃残液，空柱放回收集管，再12,000g离心2分钟。室温敞开放置2分钟，使吸附柱中残余漂洗液彻底挥发。9.将离心柱放入一个干净的1.5ml离心管，加入2050ul去离子水到柱子内部中央，室温放置2分钟， 12,000rpm离心1分钟。收集管中的溶液即为已纯化的GAPDH基因DNA片段。pMD18-T Vector图谱连接1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 l。 pMD18-T Vector*1 1 l DNA 3.5 ldH2O up to
14、 5 l 2）加入5 l（等量）的 Solution I。 3）16反应30分钟。 转化转化(Transformation)：是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-, M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 CaCl2转化原理 正在生长的大肠杆菌在0C下加入到低渗的冰冷的CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀成球（感受态细胞）。感受态细胞与外源质粒DNA形成一种黏着在细胞表面上的对DNA酶抗性的
15、羟基钙磷酸复合物。42C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。转化步骤1. 于超净台中取连接产物10l与100l大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴中30分钟。2. 42热休克90秒，置冰浴中3-5分钟。3. 于超净台中加LB培养基900l，37水浴1小时。4. 4000rpm离心3分钟，弃上清，取残余液体重悬细菌。4. 取l上述混合物均匀涂布于含100g/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。5. 37孵箱培养1216小时，可见长出单菌落。6. 挑选单菌落，使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，或提质粒酶切、测序鉴定。
