《质粒DNA的酶切鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒DNA的酶切鉴定（37页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验二实验二 质粒质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳11. 实验目的和要求实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是理解限制性内切酶是DNA重组技术的重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定定DNA片段的有效方法。片段的有效方法。 22. 相关基础知识相关基础知识 限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶：是是一一类类能能识识别别双双链链DNA分分子子特特异异性性核核酸酸序序列列的的DNA水水解解酶酶。是是体体外外剪剪切切
2、基基因因片片段段的的重重要要工工具具，所所以以常常常常与与核核酸酸聚聚合合酶酶、连连接接酶酶以以及及末末端端修修饰饰酶酶等等一一起起称称为为工工具具酶酶。限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶不不仅仅是是DNA重重组组中中重重要要的的工工具具，而而且且还还可可以以用用于于基基因因组组酶切图谱的鉴定。酶切图谱的鉴定。31) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象2) 核酸限制性内切酶的类型核酸限制性内切酶的类型3) 核酸限制性内切酶的基本特性核酸限制性内切酶的基本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5) 核酸限制性内切酶的命名法核酸限制性内切酶的命名法6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影
3、响核酸限制性内切酶活性的因素41) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各各种细菌都能合成一种或几种能够切割种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限进行了修饰，限制性酶对修饰过的制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现不能起作用
4、。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。象被称为寄主控制的限制与修饰现象。52)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：断核酸的情况不同，分为三类： 型型 型型* 型型6第一类（第一类（I I型）限制性内切酶型）限制性内切酶能识别专一能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割苷酸上切割DNADNA分子中的双链，但是切割分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶
5、在类限制性内切酶在DNADNA重组技术或基因工重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析程中用处不大，无法用于分析DNADNA结构或结构或克隆基因。这类酶如克隆基因。这类酶如EcoEcoB B、EcoEcoK K等。等。 7第第二二类类(II(II型型) )限限制制性性内内切切酶酶能能识识别别专专一一的的核核苷苷酸酸顺顺序序，并并在在该该顺顺序序内内的的固固定定位位置置上上切切割割双双链链。由由于于这这类类限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别和和切切割割的的核核苷苷酸酸都都是是专专一一的的。因因此此，这这种种限限制制性性内内切切酶酶是是DNADNA重重组组技技术术中中最最常常用用的的工工具具酶
6、酶之之一一。这这种种酶酶识识别别的的专专一一核核苷苷酸酸顺顺序序最最常常见见的的是是4 4个个或或6 6个个核核苷苷酸酸，少少数数也也有有识识别别5 5个个核核苷苷酸酸以以及及7 7个个、8 8个个、9 9个个、1010个个和和1111个个核核苷苷酸酸的的。 II II 型型限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别顺顺序序是是一一个个回回文文对对称称顺顺序序，即即有有一一个个中中心心对对称称轴轴，从从这这个个轴轴朝朝二二个个方方向向“读读”都都完完全全相相同。这种酶的切割可以有两种方式：同。这种酶的切割可以有两种方式：8粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，粘性末端；是交错切割，结果形成两条
7、单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。所以称为粘性末端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为：的识别顺序为： 5 GAA|TT_C 3 5 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5 3 C_TT|AAG 5垂垂直直线线表表示示中中心心对对称称轴轴，从从两两侧侧“读读”核核苷苷酸酸顺顺序序都都是是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，这这就就是是回回文文顺顺序序（palindromepalindrome）。_ _和和表表示示在在双双链链上上交交错错切切割割的的位位置置，切切割割后后生生成成5G5G和和
8、AATTC3AATTC3、3CTTAA3CTTAA和和G5G5二二个个DNADNA片片段段，各各有有一一个个单单链链末末端端，二二条条单单链链是是互互补补的的，其其断断裂裂的的磷磷酸酸二二酯酯键以及氢键可通过键以及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而“粘合粘合”。9IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如上切割双链，产生平头末端。例如EcoEcoRV RV 的识别位置是：的识别位置是： 5 GAT|ATC 35 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 3 CTA|TAG 5 切割后形成切割后形成5 GAT5 GAT和
9、和ATC 3ATC 3、 3 CTA3 CTA和和TAG 5TAG 5。这种末端。这种末端同样可以通过同样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端：平头末端：10第三类（第三类（ IIIIII型型）限制性内切酶）限制性内切酶也有专一也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序的识别顺序，但不是对称的回文顺序, ,在识在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度定长度DNADNA片段，具有各种单链
10、末端。因此片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。不能应用于基因克隆。11同裂酶：同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，有时其差别只在于当和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如如HpaHpa和和MspMsp的识别顺序都是的识别顺序都是5GCG_G35GCG_G3，如果其中有，如果其中有5-5-甲基胞嘧啶，则只有甲基胞嘧啶，则只有HpaHpa能够切割。这些能够切割。这些有相同切点的酶称为
11、有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异同裂酶（同切酶或异源同工酶）源同工酶）。 3） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：12有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶同尾酶，可以通过可以通过DNADNA连接酶将这类末端连接起来，但连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如一个新的酶切位点。如XbaXba1 1、NheNhe1 1以及以及SpeSpe1 1切割的切割的DNADNA序列不同，但均给出相同的序列不同，但均给出
12、相同的“CTAG”“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的的4 4核苷酸的酶切位点，即核苷酸的酶切位点，即 BfaBfa1 1的酶切位点。的酶切位点。同尾酶：同尾酶：134) 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v用用属属名名的的头头一一个个字字母母和和种种名名的的头头两两个个字字母母表表示示寄寄主主菌菌的的物物种种名名称称，如如E. coli 用用Eco表表示，所以用斜体字。示，所以用斜体字。v用用一一个个字字母母代代表表菌菌株株或或型型，如如流流感感嗜嗜血血菌菌Rd菌株
13、用菌株用d，即，即Hind。v如如果果一一种种特特殊殊的的寄寄主主菌菌株株，具具有有几几个个不不同同的的限限制制与与修修饰饰体体，则则以以罗罗马马数数字字表表示示，如如Hind, Hind，Hind等。等。145) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度；的纯度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(4) DNA的分子结构；的分子结构；(5) 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(6) 缓冲液的缓冲液的 pH值。值。15琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后琼脂糖
14、凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。可以向阳极迁移。影响影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分分子的大小、子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。成。16琼琼脂脂糖糖凝凝的的浓浓度度影影响响给给定定大大小小的的线线状状DNA的的
15、迁迁移移率率，因因此此采采用用不不同同浓浓度度的的凝凝胶胶可可以以分分离离不不同同大大小小范范围围的的DNA片片段段。0.8%的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶能能很很好好地地分分辨辨1-25kb的的片片段段；0.5% 的的琼琼脂脂糖糖 凝凝 胶胶 用用 于于 分分 辨辨 较较 大大 片片 段段 的的 DNA (20-100kb）；对对于于小小片片段段的的DNA(0.2-2kb) 可可用用1.5%或或更更高高浓浓度度的的凝凝胶胶进进行行分分离离。不不过过，以以上上这这些些并并不不是是绝绝对对的的，因因为为有有时时我我们们需需要要同同时时分分离离多多种种分分子子量量相相差差较较大大的的片片段段，因因此此所
16、所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。17EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲锭溴盐苯基菲锭溴盐, , (Ethidium Bromide)(Ethidium Bromide)。它能够插入。它能够插入DNADNA分子分子中的碱基对之间而与中的碱基对之间而与DNADNA结合。由于结合。由于EBEB分子分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNADNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测检测10ng 10ng 的的DNADNA。注意：注意：EBEB是一
17、种诱变剂，操作时一定是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套手套!183. 3. 实验材料与仪器实验材料与仪器质粒质粒 pCMV-Myc-T10pCMV-Myc-T10NEB NEB 标准分子量片段标准分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)EcoEcoRIRI 和和 XhoXhoI I 核酸内切酶（核酸内切酶（TakaraTakara）EcoRI和 XhoI酶解缓冲液酶解缓冲液(10H buffer)(10H buffer)琼脂琼脂糖糖TBETBE或或TAETAE缓冲液缓冲液(10)(10)溴化乙啶染色液溴
18、化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml)上样液上样液(6)(6)：0.25% 0.25% 溴酚兰，溴酚兰，4040(W/V)(W/V)蔗蔗糖糖 水溶液或水溶液或3030的甘油。的甘油。19InsertEcoRIXhoI1.9kb质粒质粒201 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder不能对不能对DNADNA质量进行精确质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大致的量比较估算出大概的数据。每条带大致的量如下（按如下（按0.5g0.5g上样量计。应按上样量计。应按1313条带计条带计算，因为算，因为3k
19、b3kb的量是其它片段量的近三倍）：的量是其它片段量的近三倍）： 1 kb DNA Marker21片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*22EcoR I 酶切位点：酶切位点：GAATT_CXho I 酶切位点：酶切位点：CTCGA_G10H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5)10H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 10
20、0mM MgCl 100mM MgCl2 2 10mM Dithiothreitol 10mM Dithiothreitol 1000mM NaCl 1000mM NaCl23酶活性的定义：酶活性的定义：一一个个活活性性单单位位（U)U)，是是指指在在5050 l l反反应应体体系系中中，3737o oC C的的条条件件下下，经经过过1 1小小时时的的反反应应时时间间，将将1 1 g g DNA DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因因为为不不同同的的酶酶所所要要求求的的最最适适反反应应条条件件不不同同，所所以以一一定定要要使使用用与与酶酶相相匹匹配配的的缓缓冲冲系系统统。一一
21、般般按按照照销销售售酶酶的的公公司司所所提提供供的的相相应应缓缓冲冲液液。双双酶酶切切或或多多酶酶切切时时要要考考虑虑相相容容性性缓缓冲冲液液问问题题，一一般般公公司会给用户提供这方面的信息。司会给用户提供这方面的信息。24电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等凝胶成像仪，一次性塑料手套等仪器设备仪器设备254. 实验方法和步骤实验方法和步骤 26质粒量质粒量质粒量质粒量（ngngngng）缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液( ( ( (llll)*)*)*)*EcoREcoREcoREcoR1 1 1 1（llll）XhoXhoXhoXho1 1 1 1（
22、llll）H H H H2 2 2 2O O O O( ( ( (llll) ) ) )总体积总体积总体积总体积（llll）I I I I2002002002002 2 2 20 0 0 00 0 0 017-1917-1917-1917-1920202020IIIIIIII2002002002002 2 2 20.50.50.50.50 0 0 015-1715-1715-1715-1720202020IIIIIIIIIIII2002002002002 2 2 20.50.50.50.50.50.50.50.514-1614-1614-1614-1620202020* * 缓冲液随不同的酶而
23、不同缓冲液随不同的酶而不同, ,本实验用本实验用 H buffer H buffer。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小时。酶解完成后，分别小时。酶解完成后，分别加入加入1010 l l 3 3倍的上样缓冲液倍的上样缓冲液, , 然后各取然后各取1515 l l进进行电泳分析。行电泳分析。1) 质粒质粒DNA的酶解（自提质粒的酶解（自提质粒pCMV-Myc-T10）272) 琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶液的制备：称取琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖，琼脂糖，置于三角瓶中，加入置于三角瓶中，加入100ml TBE或或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三
24、工作液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。283）胶板的制备）胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。梳子。 29将冷却至将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。成均匀的胶层。室温下静置室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔左
25、右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5-1TAE（Tris-乙酸）乙酸） 或或TBE（Tris-硼酸）工作硼酸）工作液的电泳槽中使用。液的电泳槽中使用。304）加样）加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容
26、量约约1520 l。1 kb DNA ladder（能见到（能见到10条带）条带）: 在第在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入一个上样孔或最后一个上样孔内加入6 l 的的 1 kb DNA ladder（50ng/ l ）。）。315）电泳（带上手套操作）电泳（带上手套操作）加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在建议在80100V的电压下电泳；的电压下电泳；当溴酚兰移动到距离胶板下沿约当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停处停止电泳；止电泳；将凝胶放入将凝胶放入溴化乙啶（溴化乙啶（EB工作液工作液（0.5 g/ml左右）中染色约左右）中染色约20min。32
27、为了获得电泳分离为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，电场强度不应高于电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太时，由于胶太稀，最好在稀，最好在4进行电泳以增加凝胶硬度。进行电泳以增加凝胶硬度。336）观察与拍照）观察与拍照在紫外灯在紫外灯(310nm波长波长)下观察染色后的凝胶。下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外存在处显示出红色的荧光条
28、带。紫外光激发光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。成象系统。34对对于于未未进进行行酶酶切切的的质质粒粒来来说说，常常会会出出现现两两条条电电泳泳带带，一一条条是是（松松弛弛）螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA带带，另另一一条条是是超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA的的带带，以以超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA居居多多，移移动动速速
29、度度也也最最快快。有有时时还还会会出出现现三三条条带带，其其中中一一条条是是因因为为有有一一些些质质粒粒DNADNA在在提提取取过过程程中中遭遭到到损损伤伤而而线线性性化化，其其移移动动速速度度介介于于螺螺旋旋状状和和超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA之之间间，所所以以该该条条电电泳泳带带位位于于上上述述两两种种带带之之间间。如如果果提提取取的的质质粒粒很很好时，这条带会很弱，有时看不到。好时，这条带会很弱，有时看不到。35Relaxed circleSuper-coiled form36学生实验结果（学生实验结果（3 个小组个小组-2003.3.25）12 3 M 1 2 3 M 1 2 3 1.未酶切质粒未酶切质粒；2. EcoRI 单酶切；单酶切；3. EcoR1+XhoI双酶切双酶切2.M. 1kb DNA Marker.37
