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1、紫外紫外可见吸收光谱可见吸收光谱现代分析技术研究中心赵娟跨越众多领域，提供完美技术跨越众多领域，提供完美技术v分析装置分析装置v测定装置测定装置v试验检查装置试验检查装置v真空机器真空机器v医疗器械等医疗器械等紫外紫外-可见分光光度法原理可见分光光度法原理(Ultraviolet and Visible Spectrophotometry, UV-Vis)2.1紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱2.2吸收光谱的测量吸收光谱的测量-Lambert-Beer定律定律2.3分析条件选择分析条件选择2.4UV-Vis分光光度法的应用分光光度法的应用UV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的
2、吸收特性。方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的吸收特性。UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在160780nm.UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光谱主要用于分子的定量分析，但紫外光谱(UV)为四大波谱之一，是鉴定为四大波谱之一，是鉴定许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。电磁波谱电磁波谱g g-X-射线射线紫外紫外可见可见红外红外微波微波无线电无线电200 400 800 10000 (nm)波长波长真空紫外真空紫外近红外近红外核磁共振核磁共振 波长越短，能量越高引起 UV/
3、VIS 吸收的原因v某些单键v大多数双键v共轭双键v某些金属与非金属化合物vN, O, S, 卤素2.1紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱一、分子吸收光谱的形成一、分子吸收光谱的形成1.过过程程：分分子子外外层层电电子子-吸吸收收外外来来辐辐射射-产产生生电电子子能能级级跃跃迁迁-分子吸收谱。分子吸收谱。基态 E0激发态 E1DE = E1 - E0 = hn能量激发激发e能量差DE有机分子包括有机分子包括:成键轨道成键轨道 、 ；反键轨道；反键轨道 *、 * ；非键轨道非键轨道n；可能的跃迁类型：可能的跃迁类型： - *； - *； - *；n- *； - *；n- *二、分子吸收光谱跃迁类
4、型二、分子吸收光谱跃迁类型 n 非成键轨道 s 成键轨道p * 反键轨道 p 成键轨道s * 反键轨道Energy level-*跃迁，能量很高。电子以单键存在，如饱和碳氢 化合物，一般在波长220nm 时无强的紫外吸收； n -*跃迁，能量相对较高。化合物中含有非键合的O， N，S，或X- 的电子。在紫外区有强吸收；-*跃迁、 n -*跃迁，能量较低。含有双键，螯合双键 芳香烃，闭环芳香烃及杂环芳香烃的化合物。 紫外和可见区有中等至强的吸收。只只有有 - *和和n- *两两种种跃跃迁迁的的能能量量小小，相相应应波波长长出出现现在在近近紫紫外外区区甚甚至至可可见见光区，且对光的吸收强烈，是我们
5、研究的重点。光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。 - -胡罗卜素胡罗卜素咖啡因咖啡因阿斯匹林阿斯匹林丙酮丙酮几几种种有有机机化化合合物物的的分子吸收光谱图。分子吸收光谱图。2.2吸收光谱的测量吸收光谱的测量-Lambert-Beer定律定律一、透射率一、透射率入射光I0透射光 I光程长b 透射率 T% =II0X 100%二、二、Lambert-Beer 定律定律当当入入射射光光波波长长一一定定时时，待待测测溶溶液液的的吸吸光光度度A与与其其浓浓度度和和液液层层厚厚度度成成正比，即正比，即k 为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。当浓度以
6、当浓度以g/L 表示时，称表示时，称k 为吸光系数，以为吸光系数，以a 表示，即表示，即当浓度以当浓度以mol/L表示时，称表示时，称k 为摩尔吸光系数，以为摩尔吸光系数，以 表示，即表示，即 比比a 更更常常用用。 越越大大，表表示示方方法法的的灵灵敏敏度度越越高高。 与与波波长长有有关关，因因此此， 常以常以 表示。表示。A=-lgT%=lgI0/I=Kbc三、偏离三、偏离L-B 定律的因素定律的因素样样品品吸吸光光度度A 与与光光程程b 总总是是成成正正比比。但但当当b 一一定定时时，A 与与c 并并不不总是成正比，即偏离总是成正比，即偏离L-B 定律！这种偏离由样品性质和仪器决定。定律
7、！这种偏离由样品性质和仪器决定。1.样品性质影响样品性质影响a）待测物高浓度）待测物高浓度-吸收质点间隔变小吸收质点间隔变小质点间相互作用质点间相互作用对特定辐射对特定辐射的吸收能力发生变化的吸收能力发生变化- 变化；变化；b）试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配）试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；c）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；d）胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。）胶体、乳状液或
8、悬浮液对光的散射损失。浓度影响l适用于稀溶液l高浓度区偏离线形范围 ( 0.01 M)High concentrationmore molecules are packed in one volume化学反应影响lDeviation from linearity may caused by分析物分解分析物缔合分析物与溶剂发生反应杂散光影响1.02.0 0 2.5 5.0 7.5 10.0Concentration, M * 103Absorbance0.0 %0.2 %1.0 %5.0 %Stray light = * 100IsIoDiagram was taken from : Dougl
9、as A. Skoog and James J. Leary, Principles ofInstrumental Analysis, 4th ed., Saunders College Publishing, 1992, page 131.pH 值的影响Diagram taken from: James D. Ingle Jr. and Stanley R. Crouch, SpectrochemicalAnalysis, prentice-Hall International Editions, page 3741.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10325 400
10、475 550 625 700 (nm) Absorbance10986.869876.86.56酚红不同pH 值的吸收2.3分析条件选择分析条件选择一、仪器测量条件一、仪器测量条件当分析高浓度的样品时，误差更大。当分析高浓度的样品时，误差更大。由由L-B定律：定律：微分后得：微分后得：将上两式相比，并将将上两式相比，并将dT 和和dc 分别换为分别换为 T 和和 c，得，得当当相相对对误误差差 c/c 最最小小时时，求求得得T=0.368 或或 A=0.434。即即当当A=0.434 时，吸光度读数误差最小！时，吸光度读数误差最小！通通常常可可通通过过调调节节溶溶液液浓浓度度或或改改变变光光
11、程程b来来控控制制A的的读读数数在在0.151.00范围内。范围内。二、反应条件选择二、反应条件选择1.显色剂的选择原则：显色剂的选择原则：使使配配合合物物吸吸收收系系数数 最最大大、选选择择性性好好、组组成成恒恒定定、配配合合物稳定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大等。物稳定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大等。2.显色剂用量：显色剂用量：配配位位数数与与显显色色剂剂用用量量有有关关；在在形形成成逐逐级级配配合合物物，其其用用量量更要严格控制。更要严格控制。3.溶液酸度：配位数和水解等与溶液酸度：配位数和水解等与pH 有关。有关。4.显色时间、温度、放置时间等。显色时间、温度、放置时
12、间等。三、参比液选择三、参比液选择1.溶溶剂剂参参比比：试试样样组组成成简简单单、共共存存组组份份少少（基基体体干干扰扰少少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；2.试试剂剂参参比比：当当显显色色剂剂或或其其它它试试剂剂在在测测定定波波长长处处有有吸吸收收时时，采用试剂作参比（不加待测物）；采用试剂作参比（不加待测物）；3.试试样样参参比比：如如试试样样基基体体在在测测定定波波长长处处有有吸吸收收，但但不不与与显显色色剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。四、干扰消除四、干扰消除1.
13、控制酸度：控制酸度：配配合合物物稳稳定定性性与与pH有有关关，可可以以通通过过控控制制酸酸度度提提高高反反应应选选择择性性，副副反反应应减减少少，而而主主反反应应进进行行完完全全。如如在在0.5MH2SO4介介质质中中，双双硫硫腙腙与与Hg2+生生成成稳稳定定有有色色配配合合物物，而而与与Pb2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+等离子生成的有色物不稳定。等离子生成的有色物不稳定。2.选择掩蔽剂选择掩蔽剂3.合适测量波长合适测量波长4.干扰物分离干扰物分离5.导数光谱及双波长技术导数光谱及双波长技术二、定量分析二、定量分析1.单组份定量方法单组份定量方法1）标准曲线法（略）标准曲线法（略）2）标准
14、对比法：）标准对比法：该该法法是是标标准准曲曲线线法法的的简简化化，即即只只配配制制一一个个浓浓度度为为cs的的标标准准溶溶液液，并并测测量量其其吸吸光光度度，求求出出吸吸收收系系数数k，然然后后由由Ax=kcx求出求出cx该该法法只只有有在在测测定定浓浓度度范范围围内内遵遵守守L-B定定律律，且且cx与与cs大大致相当时，才可得到准确结果。致相当时，才可得到准确结果。校正曲线Analyte concentration (ppm)AbsorbanceSlope m = e lAbs = m*Concentration + K0紫外可见分光光度计 UV2550紫外-可见分光光度计的结构紫外紫外-
15、 -可见分光光度计的基本结构是可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：由五个部分组成：l光源光源l单色器单色器l吸收池吸收池l检测器检测器l数据系统数据系统紫外-可见分光光度计的结构（一）光源（一）光源 热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯，钨灯和碘钨灯可使用的范围在卤钨灯，钨灯和碘钨灯可使用的范围在3403402500nm 2500nm ； 气体放电光源用于紫外光区，如氘灯。气体放电光源用于紫外光区，如氘灯。它可在它可在160160375 nm375 nm范围内产生连续光源。氘范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光灯的灯管内充有氢
16、的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源。区应用最广泛的一种光源。氘灯：紫外区，氘灯：紫外区，190nm-光源转换波长（光源转换波长（282-393nm）钨灯：可见钨灯：可见-近红外，光源转换波长近红外，光源转换波长-3200nm （二）单色器（二）单色器单色器主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫单色器主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。外可见区域内任意可调。 单色器一般由入射狭缝、准光器、色散元件、聚焦元单色器一般由入射狭缝、准光器、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。单色器的性能直接影响入件和出射狭缝等几部分组成。单色器的性能直接影响入射光的单色性，
17、从而也影响到测定的射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度、选择性及灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系校准曲线的线性关系等。狭缝的大小直接影响单色光纯等。狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱光强。度，但过小的狭缝又会减弱光强。紫外-可见分光光度计的结构AFM显微镜下的光栅图像（三）吸收池（三）吸收池 吸收池用于盛放分析试样，一般有吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料石英和玻璃材料两两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。用于可见光区。 为减少光的损失，吸收池的为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂
18、直于光光学面必须完全垂直于光束方向束方向。 在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池吸收池要挑选配对要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。的光程长度的精度等对分析结果都有影响。（四）检测器（四）检测器 常用的检测器有光电池和光电倍增管等。常用的检测器有光电池和光电倍增管等。 硅光电池对光的敏感范围为硅光电池对光的敏感范围为190-1100nm190-1100nm。但由于容易。但由于容易出现疲劳效应而只能用于中低档的分光光度计中。出现疲劳效应而只能用于中低档的分
19、光光度计中。 光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电池要高敏度比一般的光电池要高200200倍，因此可使用较窄的单色倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。紫外可见区：光电倍增管（紫外可见区：光电倍增管（PMT）近红外区近红外区：PbS光电池光电池切换波长切换波长：750-895nm（五）数据系统（五）数据系统 它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。现在一般的紫外可见分光光度计有计算机控制和主机单
20、现在一般的紫外可见分光光度计有计算机控制和主机单片机控制两种类型，功能基本类似。片机控制两种类型，功能基本类似。 紫外紫外- -可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类型，即单光可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和比例双光束分光光度计。束分光光度计、双光束分光光度计和比例双光束分光光度计。1 1，单光束分光光度计，单光束分光光度计 经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构
21、简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。维修容易，适用于常规分析。2 2，双光束分光光度计，双光束分光光度计 经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光。经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光。紫外紫外- -可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型 一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。 双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。双光束分光光度计
22、一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。除光源强度变化所引起的误差。3 3，比例双光束分光光度计，比例双光束分光光度计 由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束通过样品后到达另一个检测器。这种仪检测器，另一束通过样品后到达另一个检测器。这种仪器的优点是可以监测光源变化带来的误差，但是并不能器的优点是可以监测光源变化带来的误差，但是并不能消除参比造成的影响。消除参比造成的影响。常见附件常见附件l比色皿 （长光程、短光程，微量池）l池架（4联，恒温，微量）l自动分析（Sipper）l积分球l软件分析混浊、固体、不透明样品的积分球分析混浊、固体、不透明样品的积分球
