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1、l生物化学实验之生物化学实验之实验四实验四 乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白 1【实验目的】【实验目的】 学习乙酸纤维素薄膜电泳的原理，掌握有关学习乙酸纤维素薄膜电泳的原理，掌握有关操作技术。操作技术。【实验原理】【实验原理】 电泳电泳:带电粒子在电场的作用下，向着与其电带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的方向泳动的现象。性相反的方向泳动的现象。 由于被分离物质所带电荷的性质、数量和分由于被分离物质所带电荷的性质、数量和分子的大小以及形状不同，在同一电场作用下其移子的大小以及形状不同，在同一电场作用下其移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率动方向和移动速
2、度也不同，即它们的电泳迁移率（）不同。因此，经过一定时间电泳后即可被）不同。因此，经过一定时间电泳后即可被2分离开来。利用此性质，将混合物中各组分进行分离开来。利用此性质，将混合物中各组分进行分离分析的方法称为电泳法。分离分析的方法称为电泳法。 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。值、溶液的离子强度和电渗现象。 影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。荷的量、质点的大小和形状。 3l血清蛋白血清蛋白 组分组分蛋白质名称蛋白质名称等等 电电 点点（pIp
3、I）相对分子质量相对分子质量白蛋白白蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白4.84.85.065.065.065.065.125.126.856.857.57.5690006900020000020000030000030000090000900001500001560003000004 血清中各主要蛋白质的等电点均低于血清中各主要蛋白质的等电点均低于pH8.6，在该缓冲液中均带负电荷，在电场中，在该缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动。向正极移动。 以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示
4、的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条条主要区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余主要区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为依次为1-、2-、-及及-球蛋白。球蛋白。 5【实验材料与试剂】【实验材料与试剂】（一）醋酸纤维薄膜（一）醋酸纤维薄膜（28 cm）、电泳仪、电泳）、电泳仪、电泳槽、点样器（盖玻片）、载玻片、培养皿、镊子槽、点样器（盖玻片）、载玻片、培养皿、镊子（二）新鲜血清、巴比妥（二）新鲜血清、巴比妥/钠缓冲液（钠缓冲液（pH8.6， 离子强度离子强度0.07）、染色液（氨基黑）、染色液（氨基黑10B）、漂洗）、漂洗液液 6【实验步骤】【实验步骤】 1. 薄膜的处理薄膜的处理 将醋酸纤
5、维薄膜置于盛有巴比妥将醋酸纤维薄膜置于盛有巴比妥/钠缓冲液钠缓冲液的平皿中，浸泡的平皿中，浸泡30 min以上。以上。 用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸去多余的缓冲液，然后平铺在载玻片上（无光吸去多余的缓冲液，然后平铺在载玻片上（无光泽面朝上）。泽面朝上）。7 用毛细管取一滴血清，滴在另一用毛细管取一滴血清，滴在另一 载玻片载玻片上，用盖玻片的一侧边在血清上均匀蘸一下，上，用盖玻片的一侧边在血清上均匀蘸一下，再轻轻印在薄膜点样处片刻，使血清渗透到薄再轻轻印在薄膜点样处片刻，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。膜内，形成均匀的直线。2. 点样点样83
6、. 电泳电泳 将薄膜平贴在电泳槽支架上，点样端将薄膜平贴在电泳槽支架上，点样端在阴极。两端用已浸透缓冲液的纱布压在阴极。两端用已浸透缓冲液的纱布压住（引桥）。住（引桥）。9 盖上电泳盖上电泳槽盖，使薄膜平槽盖，使薄膜平衡衡10 min。 连接电源、连接电源、电极线。电极线。10 通电，调节电压至通电，调节电压至100 V，电流强度为，电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约膜宽度，电泳时间约45 60 min 。114. 染色染色 电泳完毕后将薄膜取下电泳完毕后将薄膜取下, 放在氨基黑放在氨基黑10B染色液中浸泡染色液中浸泡5 10min。5. 漂洗漂洗 将薄膜从染色液中取出后移置
7、漂洗液中将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱止，可得到色带清晰的电泳图谱 。+-12【注意事项】【注意事项】 1. 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的选择与浸润是电泳成败的关键之一。若膜的选择与浸润是电泳成败的关键之一。若浸透后的薄膜色泽均匀，深浅一致，则可用浸透后的薄膜色泽均匀，深浅一致，则可用于电泳于电泳 。 2. 醋酸纤维素薄膜电泳常选用醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.050.09 mol
8、/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。关。13 3. 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不齐，影响分离效果始点参差不齐，影响分离效果 。 4. 点样时，点样不要过多，恰到好处，点样时，点样不要过多，恰到好处，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。14 5. . 放薄膜的时候要注意放平，与纱布充放薄膜的时候要注意放平，与纱布充分接触，但不要接触点样端分接触，但不要接触点样端 。 6. 6. 电泳时应选择合适的电流强度，一般电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为电流强度为0.40.40.6mA/cm0.6mA/cm膜宽度。电流强膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散动速度慢且易扩散 。 15
