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1、流式细胞仪的原理及应用流式细胞仪的原理及应用马马 黎黎 明明1;.2流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念流式细胞术流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性能快速、精确的对单个细胞理化特性（如大小、内部结构、（如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋、蛋白质、抗原等）白质、抗原等）进行多参数定量分析和分选的新技术。进行多参数定量分析和分选的新技术。 3流流 式式 细细 胞胞 术术 的的 特特 点点 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被流式细胞术最大的特点
2、是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量4流式细胞仪的基本概念流式细胞仪的基本概念 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是集激光技术、电集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体子物理技术、光电测量技术、电子计算机技
3、术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。技术为一体的一种新型高科技仪器。5BD FACSCantoBD FACSCanto流式细胞分析仪流式细胞分析仪 6流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构细胞大小细胞大小细胞颗粒度细胞颗粒度DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期RNARNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能 细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特异核的特异 性性抗原抗原 细胞活性细胞活性 细胞内细胞内/外的细胞因子外的细胞因子 激素结合位点激素结合位点 细胞受体细胞受体 钙离子浓度钙离子浓度 线粒体膜电位线粒体膜电位 7一、流式细胞仪的工作
4、原理一、流式细胞仪的工作原理n采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；n利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；n用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。保证了检测速度与统计分析精确性。 81.1.流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的基本结构（1） 液流系统液流系统（2） 光学系统光学系统（3）
5、 数据处理系统数据处理系统9（1 1）液）液 流流 系系 统统n由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成n待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流从样品管进入流动室形成样本流n鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。10液液 流流 系系 统统 示示 意意 图图11液流速度：低速、
6、中速、高速液流速度：低速、中速、高速低速：低速：10ul/min; 中速：中速：60ul/min; 高速：高速：120ul/min.12（2 2）光）光 学学 系系 统统 由激光光源由激光光源、分色反光镜分色反光镜、光束成形器光束成形器、透镜组透镜组、滤片和光电倍增管组成。滤片和光电倍增管组成。FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector13（3 3）数）数 据据 处处 理理 系系 统统 主要由计算机和及其软件（主要由计算机和及其软件（BD FASCDivaBD FASCDiva
7、和和BD ModFit LTBD ModFit LTTMTM）组成）组成。14流流 式式 细细 胞胞 仪仪 与与 显显 微微 镜镜 的的 区区 别别区别区别流式细胞仪流式细胞仪光学显微镜光学显微镜光源光源激光激光自然光、灯光自然光、灯光对象对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子细胞、组织等细胞、组织等承载工具承载工具鞘液及流动室鞘液及流动室载玻片载玻片检测信号检测信号光学信号光学信号形态及染色形态及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大电路、放大电路目镜目镜物镜、光学放大物镜、光学放大统计统计计算机计算机人工人工结果结果多参数，综合分析多参数，综合分析简单，单参数简单，单参数15二、散二、散 射射
8、光光 的的 测测 量量 细胞在液柱中与激光束相交时向周围细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射前向散射光光和侧向散射光侧向散射光。16前前 向向 散散 射射 光（光（FSFS） 前向散射光（前向散射光（forward scatter, FSforward scatter, FS）： 激光束照射细胞时，光以相对轴激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度较小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属
9、性，向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比信号强弱与细胞体积大小成正比。 通常在通常在FCM应用中，选取应用中，选取FS作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。17前前 向向 散散 射射 光光 示示 意意 图图FALS SensorLaser18侧侧 向向 散散 射射 光（光（SSSS） 侧向散射光（侧向散射光（side scatter, SSside scatter, SS）：）：激光束照射细胞时，光以激光束照射细胞时，光以9090角散射的角散射的讯号，
10、用于检测细胞内部结构属性。讯号，用于检测细胞内部结构属性。19侧侧 向向 散散 射射 光光 示示 意意 图图FALS Sensor90LS SensorLaser20 光光 散散 射射 测测 量量 的的 用用 途途 测得的测得的FS与与SS信号通过计算机处信号通过计算机处理，可得到理，可得到FS-SS图，由此可仅用散图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。能分析表面分子。光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出
11、某些亚群 21三、荧三、荧 光光 的的 测测 量量n荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。激发光波长不同。n每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。n选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。22荧荧
12、 光光 染染 料料 的的 特特 性性激发波长激发波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)23荧荧 光光 信信 号号 的的 检检 测测n使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析n荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量24四、细四、细 胞胞 分分 选选 原原 理理 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。研究时进行的。25细细 胞胞 分分 选选 示示
13、 意意 图图细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电26五、数五、数 据据 的的 显显 示示 与与 分分 析析n参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FLn数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双参数散点图、双参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维等高图、假三维等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）n设门分析技术设门分析技术27（一）参（一）参 数数 说说 明明FSFS：反映颗粒的大小
14、：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少28（二）（二）数数 据据 显显 示示 方方 式式直分析方图直分析方图n单参数直方图单参数直方图n双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图n三参数直方图三参数直方图n多参数分析多参数分析291.1.单单 参参 数数 直直 方方 图图 由一维参数由一维参数( (散射光或荧光散射光或荧光) )与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。荧光强度的颗粒数
15、量的多少。30单单 参参 数数 直直 方方 图图细细胞胞相相对对数数量量信道信道(channel (channel ) )312.2.双双 参参 数数 直直 方方 图图n双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。数就可以确定细胞在图上的表达位置。n双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。胞，点图利用颗粒密
16、度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。32双双 参参 数数 直直 方方 图图 点点 图图绿色荧光强度绿色荧光强度红红色色荧荧光光强强度度33（三）设（三）设 门门 分分 析析 技技 术术 1.Gate 1.Gate设置：指根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。设置：指根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。门。34A 淋巴细胞淋巴细胞B 单核细胞单核细胞C 中性粒细胞中性粒细胞A、B、C均为任均为任意门意门35线性门线性门3
17、6 2. 区阈（区阈（RegionRegion设置设置）: 如十字门分析时，由四个区阈如十字门分析时，由四个区阈构成，即构成，即G=D1+D2+D3+D4。 D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4- /CD3-D4：CD4- /CD3+37六、流式细胞仪免疫分析的技术要求六、流式细胞仪免疫分析的技术要求 n样本制备样本制备n标记染色标记染色n质量控制质量控制38（一）免（一）免 疫疫 样样 品品 的的 制制 备备培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞脱落使贴壁细胞脱落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤单细胞悬液单细胞悬液39
18、单单 细细 胞胞 悬悬 液液 的的 制制 备备 与与 保保 存存新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备n机械法机械法n酶处理法酶处理法n化学试剂处理法化学试剂处理法n表面活性剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存n深低温保存法（一年）深低温保存法（一年）n乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周）n甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）40（二）常（二）常 见见 的的 荧荧 光光 染染 料料名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488
19、488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，
20、成本高41（三）免（三）免 疫疫 荧荧 光光 标标 记记荧光染料与细胞成分的四种结合方式荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式结构亲和式嵌入结合嵌入结合共价键结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法免疫荧光标记方法直标直标: :干扰少干扰少, ,但需购买多种单抗但需购买多种单抗间标间标: :步骤多步骤多, ,干扰多干扰多, ,不需标记多种抗体不需标记多种抗体42（三）流式细胞免疫学技术的质量控制（三）流式细胞免疫学技术的质量控制1.1.单细胞悬液制备的质控单细胞悬液制备的质控n适当的制备方式适当的制备方式n实体组织来源标本用机械法实体组织来源标本用机械法n
21、温度温度25-3725-37，pH7.0-7.2pH7.0-7.2432. 免疫荧光染色的质控免疫荧光染色的质控n温度温度npHpHn染料浓度染料浓度n固定剂固定剂443. 仪器操作的质控仪器操作的质控n光路与流路校正光路与流路校正: : 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CVCV）。）。nPMTPMT（光电倍增管）校准（光电倍增管）校准: : 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。n绝对计数校准绝对计数校准: : 保证计数的准确性。保证计数的准确性。454. 免疫检测的质控免疫检测的质控n同型
22、对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗未标记单抗作为对照作为对照调整和设置电压，以保证特异性。（通常采用未染色细胞作为阴性对照）调整和设置电压，以保证特异性。（通常采用未染色细胞作为阴性对照）n全程质量控制：同型对照与待测标本一起标记和检测，该实验结果可靠。全程质量控制：同型对照与待测标本一起标记和检测，该实验结果可靠。46七、七、流流 式式 细细 胞胞 仪仪 的的 科科 研研 应应 用用=树突细胞研究树突细胞研究=干细胞研究干细胞研究=癌症病人的多药耐药性癌症病人的多药耐药性=细胞动力学功能研究细胞动力学功能研究=环境微
23、生物分析环境微生物分析=流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术与分子生物学研究=流式细胞术在免疫检验中的应用流式细胞术在免疫检验中的应用47FCM 在在 细细 胞胞 生生 物物 学学 中中 的的 应应 用用48DNA DNA 细细 胞胞 周周 期期 分分 析析Scell divisionG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)49 细细 胞胞 周周 期（期（cell cycle）G1G1期期(DNA(DNA合成前期合成前期) )从有丝分裂到从有丝分裂到DNADNA复制前的一段时期，此期主要合成复制前的一段时期，此期主要合成RNARNA和核糖和核糖体。体。 S S 期期(DNA(D
24、NA合成期合成期) )除了合成除了合成DNADNA外，同时还要合成组蛋白。外，同时还要合成组蛋白。DNADNA复制所需要的酶都在复制所需要的酶都在这一时期合成。这一时期合成。 G2G2期期(DNA(DNA合成后期合成后期) ) 大量合成大量合成RNARNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。M M期（细胞分裂期）由一个母细胞分裂成为两个子细胞期（细胞分裂期）由一个母细胞分裂成为两个子细胞 。G0G0期（细胞休眠期）暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功能的细期（细胞休眠期）暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功能的细胞所处的时期胞
25、所处的时期 。 5051PIPI染色检测细胞周期染色检测细胞周期 ProtocolProtocol n离心收集细胞，弃上清，用离心收集细胞，弃上清，用PBSPBS洗细胞两次。洗细胞两次。n加入预冷的加入预冷的70%70%乙醇，于乙醇，于4 40 0C C固定过夜，或固定过夜，或-20-200 0C C长期固定。长期固定。n细胞染色：离心收集细胞，用细胞染色：离心收集细胞，用1mlPBS1mlPBS洗细胞一次，加入洗细胞一次，加入500ulPBS500ulPBS（含（含50ug/ml50ug/ml溴化溴化乙锭（乙锭（PIPI），），100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-10
26、0)4100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)40 0C C避光孵育避光孵育3030分钟。分钟。n流式细胞仪检测：一般细胞计数流式细胞仪检测：一般细胞计数2-32-3万个。结果用软件万个。结果用软件ModfitModfit分析。分析。52 Modfit LT Modfit LT 分分 析析 细细 胞胞 周周 期期5354 细细 胞胞 周周 期期 结结 果果 分分 析析nCVCV值：又称为变异系数，一般值：又称为变异系数，一般CVCV值越小，峰型越好，越尖锐。能控制在值越小，峰型越好，越尖锐。能控制在5%5%左右是比较好的结果，一般小于左右是比较好的结果，一般小于10
27、%10%就可以认可了。就可以认可了。nG2/G1G2/G1为为1.82.1.82.（即（即G2G2期是四倍体细胞，而期是四倍体细胞，而G1G1期是二倍体细胞，比值应为期是二倍体细胞，比值应为1.8-2.01.8-2.0之间。若小于之间。若小于1.81.8，则细胞染色不充分，则细胞染色不充分。55Peng zhang; Free Radical Research,2009,43(3):224-233.56 细细 胞胞 凋凋 亡亡 的的 检检 测测n细胞形态及细胞膜通透性的变化细胞形态及细胞膜通透性的变化(Hoechest 33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）nCaspa
28、sesCaspases激活激活(Caspase-3 ) n线粒体跨膜电位降低线粒体跨膜电位降低 (Rhodamine123）n膜磷脂酰丝氨酸外化膜磷脂酰丝氨酸外化(Annexin V-FITC/PI)nCa2+ Ca2+ 浓度升高浓度升高 (Fluo-3）nDNADNA断裂及含量的变化断裂及含量的变化 (TUNEL 和 PI） 57 FCM FCM 检检 测测 细细 胞胞 凋凋 亡亡 的的 特特 点点 FCMFCM能鉴别及定量分析凋亡细胞，揭示凋亡相关的分子及其功能机能鉴别及定量分析凋亡细胞，揭示凋亡相关的分子及其功能机制，测定凋亡细胞功能特征的变化，并能对细胞的多个特征同时进行制，测定凋亡细
29、胞功能特征的变化，并能对细胞的多个特征同时进行多参数测量，还具有简便、快速、检测所需细胞量少等优点多参数测量，还具有简便、快速、检测所需细胞量少等优点 . .58 Annexin-V Annexin-V 和和 PI PI 双双 染染 protocolprotocol n细胞用冷细胞用冷PBSPBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液（洗涤二次并在恰当的染色缓冲液（binding bufferbinding buffer）中以）中以1 x 101 x 106 6 细细胞胞/mL/mL的浓度重悬的浓度重悬n吸取吸取100ul100ul的细胞的细胞(1 x 10(1 x 105 5) )至试管中。至试管中。
30、n加进适量的荧光标记的加进适量的荧光标记的annexin-Vannexin-V试剂和试剂和PIPI。n混匀后避光室温下孵育混匀后避光室温下孵育1515分钟。（必须在室温下进行）分钟。（必须在室温下进行）n孵育后加进孵育后加进400ul400ul染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析。59 Annexin-VAnnexin-V和和PIPI双染的特点和注意事项双染的特点和注意事项n检测特点：简便，快速，准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。n注意事项：1.细胞制备（如贴壁细胞）和储存时细胞膜的破损会导致磷脂酰丝氨酸(PS)跨膜分布的改变，造成假阳性。2.染色后立即上机检测。
31、60Effect of PQQ on MeHg-induced distributive change of early and late apoptotic cells. (A) control. (B) PC12 cells were treated with MeHg for 4 h. (C) Cells were pre-treated with PQQ for 30 min and then were exposed to MeHg for 4 h61Q3: 正常细胞；正常细胞；Q4：早期凋亡细胞；：早期凋亡细胞；Q2：晚期凋亡细胞；：晚期凋亡细胞；Q1：坏死细胞。：坏死细胞。62荧
32、荧 光光 补补 偿偿636465 补补 偿偿 方方 法法Annexin V-FITC和和PI双染：双染：空白对照空白对照Annexin V-FITC单染单染PI单染单染66 细胞内活性氧水平的检测（细胞内活性氧水平的检测（DCFH-DADCFH-DA）Fig. 4. Effect of ASE on the level of intracellular peroxides in RAW264.7 macrophages stimulated by LPS plus IFN-. Cellswere treated with ASE and 10g/ml LPS plus 20 U/mlIFN-
33、for 3 h. The level of intracellular peroxides was determined by labeling with DCFH-DA and the fluorescent intensity was analyzed by flow cytometer. The results arereported as meansS.D. of three independent experiments. *p 0.05 or *p 0.01 compared with the LPS plus IFN- treated cells.6768上机前使用上机前使用300目过目过滤网过滤，以防进样滤网过滤，以防进样针堵塞。针堵塞。697071Thank you for your attention!
