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1、微生物学实验三抗酸染色病毒的接种与培养真菌菌落形态观察一、一、实验目的目的1.1.掌握抗酸染色方法。掌握抗酸染色方法。2.2.了解抗酸染色的原理和意了解抗酸染色的原理和意义。抗抗酸酸染染色色Acidfaststain分枝杆菌的分枝杆菌的细胞壁内含有大量的胞壁内含有大量的脂脂质，主要是分，主要是分枝菌酸，它包枝菌酸，它包围在在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要一般不易着色，要经过加加热和延和延长染色染色时间来促来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合合后，就很后，就很难被酸性脱色被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。脱色，故名
2、抗酸染色。齐- -尼氏抗酸染色法是在加尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与条件下使分枝菌酸与石炭酸复石炭酸复红牢固牢固结合成复合物，用合成复合物，用3%3%盐酸酒精酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌复染后，分枝杆菌仍然仍然为红色，而其他色，而其他细菌及背景中的物菌及背景中的物质为兰色。色。二、二、实验原理原理细菌：卡介苗菌：卡介苗 （Bacillus Calmette-GuerinBacillus Calmette-Guerin， BCGBCG） 染液：石炭酸复染液：石炭酸复红液、液、3%3%盐酸酒精、碱性美酸酒精、碱性美 兰溶液溶液 其它：接种其它
3、：接种环、酒精灯、酒精灯、载玻片等玻片等三、三、实验材料材料1 1、细菌涂片的制菌涂片的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 2 2、染色、染色1 1）初染：用玻片）初染：用玻片夹夹持涂片持涂片标本，滴加石炭酸复本，滴加石炭酸复红2-3 2-3 滴，在火滴，在火焰高焰高处徐徐加徐徐加热，切勿沸，切勿沸腾，出，出现蒸汽即蒸汽即暂时离开，加离开，加热3 35min5min，若染液蒸，若染液蒸发减少，减少，应再加染液，以免干涸，待再加染液，以免干涸，待标本冷本冷却后用水冲洗。却后用水冲洗。2 2）脱色：）脱色： 3%3%盐酸酒精脱色酸酒精脱色30s30s1min1min；用水冲洗。；用水冲洗。3 3）
4、复染：用碱性美）复染：用碱性美兰溶液复染溶液复染1min1min；用水冲洗后用吸水；用水冲洗后用吸水纸吸干。吸干。四、方法与步四、方法与步骤五、五、实验结果果未染色未染色 初染后初染后 脱色后脱色后 复染后复染后初染初染脱色脱色复染复染石石炭炭酸酸复复红盐酸酸酒酒精精碱碱性性美美兰结核杆菌呈核杆菌呈红色，常堆色，常堆积成成团，排列无序，偶呈分枝，排列无序，偶呈分枝状生状生长。背景及非抗酸性。背景及非抗酸性细菌呈菌呈兰色。色。六、注意事六、注意事项1 1、无菌操作、无菌操作2 2、染色、染色时间3 3、初染加、初染加热的温度，勿沸的温度，勿沸腾病毒的接种与培养病毒的接种与培养真菌菌落形真菌菌落形
5、态观察察 实验目的目的了解病毒的培养方法了解病毒的培养方法掌握病毒的掌握病毒的鸡胚接种及胚接种及动物接种物接种了解常了解常见真菌的菌落特点真菌的菌落特点一一.病毒的培养病毒的培养动物接种法物接种法鸡胚培养法胚培养法组织细胞培养法胞培养法n病毒的分离培养病毒的分离培养 病毒病毒结构构简单，缺乏完整的，缺乏完整的酶系系统，不能在无生，不能在无生命的人工培养基中生命的人工培养基中生长，必，必须在活的在活的组织细胞中才胞中才能增殖。能增殖。1.动物接种（物接种（Animal inoculation）最早最早应用的病毒培养法用的病毒培养法。用途：分离用途：分离鉴定、定、传代、制代、制备免疫血清。免疫血清
6、。缺陷：缺陷：带菌，缺敏感菌，缺敏感动物。物。常用常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。物：鼠、家兔、猴和羊等。接种的途径：接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静内、鼻内、皮内、腹腔内和静脉注射等。脉注射等。病病毒毒分离材料分离材料实验动物物接种途径接种途径接种后症状接种后症状脑炎病毒炎病毒蚊体蚊体悬液、尸液、尸解解脑悬液液小鼠小鼠脑内、腹腔内、腹腔脑炎炎柯柯萨奇病毒奇病毒A组咽拭子、咽拭子、粪便便悬液、液、脑脊液、脊液、尸解尸解脑悬液液乳鼠（小于乳鼠（小于3d）皮下、皮下、脑内、内、腹腔腹腔弛弛缓性麻痹性麻痹柯柯萨奇病毒奇病毒B组咽拭子、咽拭子、粪便便悬液、液、脑脊液、脊液、尸解尸解脑悬液液乳鼠（
7、小于乳鼠（小于24h）皮下、皮下、脑内、内、腹腔腹腔震震颤、痉挛性麻痹性麻痹狂犬病病毒狂犬病病毒唾液、唾液、脑悬液液小鼠小鼠脑内内脑炎炎常用常用动物接种分离的病毒及接种途径物接种分离的病毒及接种途径 小白鼠的小白鼠的脑内接种内接种1、取取病病毒毒悬液液：用0.25ml注射器取0.1ml病 毒悬液，去除注射器内的气泡。2、固固定定小小白白鼠鼠：用左手大拇指和食指握住小白鼠的头部，手掌轻轻按住小白鼠的体部。3、消消毒毒注注射射部部位位：右手用棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右侧颞部皮毛（不碰到眼）。4、接接种种：右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与耳根联线的中点略偏耳朵的方向）注入，进入颅腔即可，（一般进针2
8、3mm）不要插得太深。5、观察察：注射完毕，将用过的注射器放入煮沸消毒器内，煮沸消毒。实验动物置于防蚊设备的室内饲养，逐日观察动物发病情况。处死小白鼠-颈椎脱臼法2.鸡胚接种胚接种接种途径接种途径可根据病毒种可根据病毒种类选择适宜接种部位，如分离适宜接种部位，如分离流感病毒常用羊水囊和尿囊同流感病毒常用羊水囊和尿囊同时接种法，而接种法，而痘病毒常采用痘病毒常采用绒毛尿囊膜接种法毛尿囊膜接种法 n尿囊腔接种法尿囊腔接种法n卵黄囊接种法卵黄囊接种法n绒毛尿囊膜接种法毛尿囊膜接种法n羊膜囊接种法羊膜囊接种法 常用常用鸡胚分离或胚分离或鉴定的病毒定的病毒病病毒毒接种途径接种途径接种后接种后变化化血清学
9、血清学诊断所用材料断所用材料痘苗病毒痘苗病毒绒毛尿囊膜毛尿囊膜痘斑痘斑产生痘斑的生痘斑的绒毛尿囊毛尿囊膜膜单纯疱疹病毒疱疹病毒绒毛尿囊膜毛尿囊膜白斑、核内包白斑、核内包涵体涵体尿囊液尿囊液流感病毒流感病毒羊水囊、尿囊羊水囊、尿囊产生血凝素生血凝素尿囊液尿囊液腮腺炎病毒腮腺炎病毒羊水囊或卵黄羊水囊或卵黄囊囊产生血凝素生血凝素羊水羊水判断判断鸡胚是否存活胚是否存活在在检卵灯下卵灯下观察能否看到清晰的血管；察能否看到清晰的血管；胚胎是否移胚胎是否移动；若胚若胚龄过长，则需需观察其胎察其胎盘部分，胎部分，胎盘部分部分变苍白白说明胚胎死亡，正常明胚胎死亡，正常时胎胎盘发暗，蛋白部分透亮。暗，蛋白部分透亮
10、。判断判断鸡胚是否存活胚是否存活气室鸡胚卵黄囊尿囊腔羊膜腔绒毛尿囊膜卵白卵膜鸡胚胚结构示意构示意图卵膜卵膜绒毛尿囊膜接种法毛尿囊膜接种法定位：将胎将胎盘部分部分 及自然气室部分用及自然气室部分用记号号 笔画出，在离开胎笔画出，在离开胎盘与与大血管区画一直径大血管区画一直径约1cm1cm的等的等边三角形三角形卵窗取卵壳：依次用碘酊，酒精消毒依次用碘酊，酒精消毒记号号处，用，用锯片将片将标记三角区卵壳三角区卵壳锯穿，（注意勿穿，（注意勿损伤卵壳卵壳下各下各层膜膜组织），取下所画三角形区域的卵壳，），取下所画三角形区域的卵壳，（注意卵壳下各（注意卵壳下各层膜膜组织），然后用），然后用针尖尖轻轻将将暴
11、露的卵膜中心刺破一个小口（不要暴露的卵膜中心刺破一个小口（不要伤及及绒毛尿毛尿囊膜）。囊膜）。造人工气室：在自然气室部分消毒后用在自然气室部分消毒后用锥子子或大注射器或大注射器针头在气室正中在气室正中钻一孔，用橡皮一孔，用橡皮头自自气室端小孔将气室中空气吸出，使气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下毛尿囊膜下陷形成一陷形成一“人工气室人工气室”。接种：去除卵膜，于去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病毛尿囊膜上滴上病毒毒0.10.2ml 0.10.2ml 。封口：用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，并通并通过火焰火焰烧去余碘。去余碘。培养：放入温箱培育放入温箱培育4 4
12、天，然后收天，然后收获病毒。病毒。二二. .真菌菌落的真菌菌落的观察（示教）察（示教）真菌培养真菌培养营养要求不高，在一般培养基上养要求不高，在一般培养基上能生能生长常用常用沙保弱（沙保弱（SabouraudSabouraud）培养基）培养基（含（含4%4%葡萄糖、葡萄糖、10%10%蛋白蛋白胨、琼脂、脂、PH4.06.0PH4.06.0），），真菌的最适酸碱度是真菌的最适酸碱度是PH4.06.0PH4.06.0，最适生，最适生长温度浅部真菌温度浅部真菌2228 2228 深部真菌深部真菌37 37 。真菌菌落真菌菌落类型型酵母型菌落（酵母型菌落（yeast colonyyeast colon
13、y） 菌落光滑、湿菌落光滑、湿润。无菌。无菌丝隐球菌菌落球菌菌落类酵母型菌落（酵母型菌落（yeast-like colonyyeast-like colony） 外外观和酵母型菌落相似，和酵母型菌落相似，显微微镜下可看到下可看到假菌假菌丝白色念株菌菌落白色念株菌菌落丝状型菌落（状型菌落（filamentous colonyfilamentous colony）菌落系由多菌落系由多细胞菌胞菌丝体所体所组成成大多数大多数丝状真菌或霉菌的菌落状真菌或霉菌的菌落新型新型隐球菌：球菌：菌落属酵母型菌落，菌落属酵母型菌落，圆形、形、较大、白色、大、白色、边缘整整齐，表面湿，表面湿润光滑，与一般光滑，与一般
14、细菌菌落相似菌菌落相似 。白色念珠菌：白色念珠菌：菌落属菌落属类酵母酵母样菌落，菌落，圆形、形、较大、白色、菌落底大、白色、菌落底层有假菌有假菌丝长入培养基内。入培养基内。表皮表皮癣菌：菌落属菌：菌落属丝状菌落，在沙保状菌落，在沙保琼脂斜面脂斜面培养基上菌落开始培养基上菌落开始为白色，白色，颗粒状，以后粒状，以后变为绒毛毛样甚至粉末状，有甚至粉末状，有许多多辐射状沟，且培养射状沟，且培养基常有基常有皱裂裂。小小孢子菌：菌落属子菌：菌落属丝状菌落，在沙保培养基上状菌落，在沙保培养基上菌落菌落为棉絮状、羊毛状或粉末状。棉絮状、羊毛状或粉末状。注意事注意事项消毒小白鼠消毒小白鼠时不要碰到眼睛不要碰到眼睛注射注射时不要扎的太深以免扎到手不要扎的太深以免扎到手磨卵壳及磨卵壳及钻孔孔时力量要适中力量要适中看看过的的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的大胚不要倒入水池，倒入指定的大烧杯中杯中实验报告简述抗酸染色原理、方法和述抗酸染色原理、方法和结果。果。绘制抗酸染色油制抗酸染色油镜下下观察察图。1.1.抗酸染色的原理是什么？有什么抗酸染色的原理是什么？有什么临床意床意义？2.2.常用的病毒分离培养的方法有哪些？常用的病毒分离培养的方法有哪些？ 思考思考题
