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1、1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序v目的基因的获取目的基因的获取v基因表达载体的构建基因表达载体的构建v将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞操作过程操作过程操作过程操作过程v目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 目的基因主要是指目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因目的基因的获取目的基因的获取供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来目前被广泛提取使目前被广泛提取使
2、用的目的基因有：苏用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因植物抗病基因（抗病（抗病毒、抗细菌毒、抗细菌) )、人胰岛人胰岛素基因等。素基因等。 1 1）从基因文库中获取目的基因）从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？种类：基因组文库：部分基因文库部分基因文库(cDNAcDNA文库文库) )：获得目的基因的方法获得目的基因的方法2）2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3 3）人工合成）人工合成 含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNA1.1.用一定
3、的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆
4、菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资资 料料:基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d
5、、标记基因、标记基因e、复制原点、复制原点( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过
6、程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质
7、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNA-DNADNA-DNA分子杂交分子杂交DNA-RNA分子杂交分子杂交抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交PCR技术聚合酶链式反应聚合酶链式反应原理：原理：PCR扩增仪扩增仪DNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理定义：定义：PCR是一项在生物体外复制是一项在生物体外复制特定特定DNA片段的核酸合成技片段的核酸合成技术术四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP) (dNTP) 一对引物：一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq酶酶）模板模板DNA( DNA( 需
8、含有目的基因需含有目的基因 ) ) MgMg2+2+( (激活剂激活剂) )条件：条件：条件：条件：缓冲溶液缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物根据这一序列合成引物前提：前提：前提：前提：5 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /G GA AC CC C5 5/ /3 3/ /引物引物G GG G变性变性复性复性延伸延伸1.目的基因目的基因DNA受热变性，解链；受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.合
9、成链在合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。5 5/ /3 3/ /A AG G引物引物PCR仪仪微量离心管微量离心管一一 次次 性性吸液枪头吸液枪头调节轮调节轮卸枪头按钮卸枪头按钮推动按钮推动按钮卸枪头器卸枪头器微量移液器微量移液器PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下， 断裂，形成断裂，形成_ _ b b、复性（复性（55-6055-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（
10、70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNA DNA (cDNA(cDNA）双链双链双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因) )反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成1）反转录法：）反转录法： 以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信使使
11、使使RNARNARNARNA为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互补的单链补的单链补的单链补的单链DNADNADNADNA，然后在酶的，然后在酶的，然后在酶的，然后在酶的作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链DNADNADNADNA，从而，从而，从而，从而获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。蛋白质蛋白质的氨基的氨基酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷酸序列酸序列结构基因结构基因的核苷酸的核苷酸序列序列目的目的基因基因推测推测推测推测化学化学合成合成2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA法法
12、 ：2.微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞3.转化方法：转化方法：大肠杆菌大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少处理细胞细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。Ca2+感受态感受态感受态感受态1.常用菌：常用菌： 目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上 农杆菌农杆菌 导入植物细胞导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 1. 1.农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子
13、叶植物和裸子植物。易感染双子叶植物和裸子植物。TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞的染色体上可转移至受体细胞的染色体上2.转转化化各种大小的电泳仪各种大小的电泳仪谱带谱带 琼脂糖凝胶电泳是重组琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状片段。不同大小、不同形状和不同构象的和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的可通过电泳
14、使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化可与荧光染料溴化乙锭（乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。可分析实验结果。1.下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作的名的名词及及对应的内容，正确的的内容，正确的组合是合是2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A. B. C. D.A.
15、B. C. D.3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接4.4. 有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料5. 5.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分( )( ) A. A.启动子启动子 B.B.终止密码终止密码 C.C.标记基因标记基因 D.D.目的基因目的基因6. 6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( )( ) A A基因枪法基因枪法 B B显微注射法显微注射法 C.C.农杆菌转化法农杆菌转化法 D D花粉管通道法花粉管通道法个人观点供参考，欢迎讨论
