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1、重点肠道传染病实验室检测方法概述襄阳市疾控中心赵耀儒2014/11/21o霍乱弧菌培养、分型操作方法。o伤寒、副伤寒培养操作方法。o细菌性痢疾（阿米巴痢疾）培养实验操作方法。、o手足口病实验操作方法。o细菌药敏试验微生物标本的采集微生物标本的采集通常有血液、脑脊液、尿液、伤口的脓液、胸水腹水、粪便、痰液及泌尿生殖系统的分泌物。1采集的一般原则：a早期采集b无菌采集o注意对局部及周围皮肤的消毒。o寄生部位采集的标本应明确目的菌，采用选择培养基。C不同菌不同采集方法D采集适量标本，量不应过少，注意采集不同时间不同部位标本，要全面。E安全采集o2标本处理2h送到检验处，部分菌应保温于一定环境中保存。
2、如尸检组织、支气管洗液、心包液、痰、尿等标本要保存于4环境中，脑脊液保存于25。注意安全尤其对烈性传染病。有时可以直接用抽取标本的注射器。o3各部位标本的采集及注意事项霍乱检验程序o标本的采集和送检o分离培养o鉴定一、标本的采集和送检1.标本的采集：标本采集的好坏，对整个检验工作的质量影响很大。粪便标本的采集应争取在发病早期，服用抗菌药物之前并尽快送到检验室。标本以病人粪便为主。采便方法可用棉拭采取自然排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内35cm处采取。采用后者应注意棉拭大小适宜，避免采便量过少。一般要求水样便采取13ml，成形便采取指甲大小的粪量。在某些情况下，病人的呕吐物
3、、沾染粪便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。2.标本的送检：采得的标本应立即接种于培养基。剧烈腹泻病人的水样便含有大量病菌（106109/ml），直接分离培养不难检出阳性。不能立即检查的，要接种于保存培养基内，尽快送往检验室。送检标本可放入碱性蛋白胨水、文碱性蛋白胨水、文腊二氏腊二氏保存液或插入保存液或插入CaryBlair二氏半固体保存培养基二氏半固体保存培养基中。后者不仅对霍乱弧菌，而且对其它肠道致病菌也有保存作用。标本与保存液的比例要适当，810ml保存液可加入13ml液体便或指甲大小的成形便，过多的大便量可降低保存液的pH值。二、分离培养方法1.直接分离培养：急性期病人水样大便标本在
4、增菌培养的同时，可取其粘液絮片或用棉拭标本直接作分离培养。这不仅能缩短检出时间，还可避免标本中其他杂菌特别是非O1群霍乱弧菌经增菌后大量繁殖而影响O1群霍乱弧菌的分离分离培养基有选择性强、弱之不同。选择性强的培养基常用的庆大霉素庆大霉素琼脂和琼脂和4号琼脂号琼脂等；选择性弱的有碱性琼脂和碱性胆盐琼脂碱性琼脂和碱性胆盐琼脂等。培养基的使用，可根据当地具体情况和各检验室的实践经验来选择。近年的趋势是使用碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基进行分离。琼脂平皿应新鲜配置，接种前培养基表面适当烘干。划线培养应掌握能分离出尽量多的单个菌落。一般每个标本接种一个平皿，必要时一个标本接种强和弱选择性培养基各一
5、个。在庆大霉素琼脂平皿上，肠内细菌和革兰氏阳性菌的生长受到显著抑制。弧菌生长快、菌落大，培养45小时，原划线处有菌台生长，810小时可长出小菌落，16小时菌落直径可达2mm。菌落弱带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润，培养时间延长或室温放置后，菌落略带黄色，中心厚而周围透明，培养基含亚碲酸钾时菌落呈灰色，中心形成黑色金属碲沉淀培养基含亚碲酸钾时菌落呈灰色，中心形成黑色金属碲沉淀。在碱性琼脂平皿上弧菌生长也较快，菌落较透明。在这些平皿上挑取菌落做玻片凝集容易形成悬液，凝集状态良好。2.增菌后分离培养：所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分
6、离不易检出，须经增菌培养再作分离。碱胨水标本管放37增菌68小时后分离，夏天可将运送时间计算在内。标本如为保存液或半固体保存培养基，则取1.0ml或将棉拭转种至810ml碱胨水中，并将棉拭内容物在胨水管壁上挤出。37培养68小时后，平稳地从温箱中取出试管架，从霍乱弧菌生长最茂盛的菌膜下表层，取一接种环，划线接种于强选择性琼脂平皿。标本含菌量少时，为提高检出率，可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌68小时的培养物的表层液0.10.2ml，接种于810ml的碱胨水中，37培养68小时再做分离。三、鉴定鉴定标准以血清学性状为主，结合形态学和生化学性状作出判定。血清学性状以玻片凝集实验为主，可疑菌落先用
7、O1群或/和O139群霍乱弧菌诊断血清作检查。玻片凝集实验玻片凝集实验：自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群或/和O139群霍乱诊断血清做玻片凝集试验。因标本中可能存在O1群、O139群或非O1群/非O139群霍乱弧菌，为减少工作量及避免遗漏，推荐使用O1群和O139群霍乱两价诊断血清，检出阳性时再用单价血清进一步鉴定。玻片凝集用血清的效价，一般应为1：401：50（不低于1：32，不高于1：64）。即根据血清原效价作适当稀释，使其效价成为1：401：50，如原效价为1：1280，制成1：50效价的血清，即须稀释1：25（12801/5025.6）使用。将稀释血清滴加在洁净的玻片或平皿内，再以接
8、种针或小接种环取可疑菌落放在血清液滴近旁，磨匀，然后混入血清内制成均匀悬液。很快（一般不超过10秒钟）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。凝集的菌落应以生理盐水作对照，检查有无自然凝集。将凝集的菌落接种普通琼脂斜面上，培养68小时后准备做进一步的鉴定，如菌落还有足够的剩余，亦可用来做单价血清的玻片凝集，以确定血清型。有的标本可能同时存在非O1群/非O139群霍乱弧菌，因此，可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查。必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集。这对一次流行的首批病人进行检查时尤应注意。此外，平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做或经增
9、菌后再做分离。有时从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清作玻片凝集，检查是否为本菌的粗糙型。伤寒杆菌检测程序一、标本采集一、标本采集用无菌方法采集新鲜标本，置于灭菌容器中，或直接接种于增菌培养基中，登记好标本号码填写送检单及时送检。运送途中严防污染及容器破损。如不能及时送检，可于4保存。为提高标本的阳性率，应根据病程的不同阶段采集不同的标本。 血：血：血标本宜在伤寒发病早期和使用抗生素前采集。以无菌方法采血5毫升。第一周血培养阳性率可达90%。伤寒患者血液中有杀伤寒菌素，胆盐可以抑制这种杀菌素的作用，故可选用葡萄胆盐肉汤增菌葡萄胆盐肉汤增菌培养基。如标本已凝固，可取出
10、血清作肥达反应，将血块搅碎后做血培养。粪便粪便：用棉拭采取患者新鲜粪便1一2克置于增菌液内，也可用缓冲甘油盐水甘油盐水或CaryBlair运送培养基保存送检。最好在用抗菌药物治疗前3天后采样。 尿：尿：病程第2、3周起，可取尿培养。用无菌导尿法或取中段尿50毫升，离心取物增菌或直接分离。骨髓骨髓：培养阳性率高，特别对经过治疗的伤寒病人，可考虑作骨髓培养。二、分离培养二、分离培养1、血标本取病人静脉血5毫升加入约10倍量的葡萄糖胆盐肉汤中，37培养，逐日观察结果。如出现混浊即可用血琼脂或血琼脂或SS、麦康凯琼脂、麦康凯琼脂进行分离培养，37培养18一24小时，挑取疑菌落作进一步鉴定。一般增菌1一
11、2天阳性率高，如至第7天培养物仍清澈透明，经接种培养仍无菌生长，则可判为阴性。2、粪便标本（1）直接分离培养将标本接种到SS和麦康凯琼脂和麦康凯琼脂上，37培养18一24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。（2）增菌培养将标本乳化后接种在改良的亚硒酸氢钠甘露醇亚硒酸氢钠甘露醇（SFM）增菌培养基中，37培养15一18小时后，再接种到SS和麦康凯琼脂和麦康凯琼脂上，37培养18一24小时后，挑取可疑菌落。3、尿、胆汁、骨髓标本取患者尿或胆汁经离心后的沉淀物或骨髓液，作直接分离或增菌分离培养，方法与粪便标本分离培养方法相同。三、鉴定1、初步生化鉴定挑取上述分离培养基上无色、透明或半透明的可疑菌落2一3个，
12、分别接种双糖铁斜面（KIA）和动力靛基质尿素半固体（MIU）各一支，37培养18一24小时，观察生化反应。若符伤寒或副伤寒杆菌生化反时，则取KIA斜面上菌苔进行血清学鉴定。2、血清学分型（1）0血清群别判定初步生化反应符合伤寒或甲、乙、丙型副伤寒杆菌时，先用AF群沙门氏“0”多价血清作玻片凝集，以判定其群别。（2）H抗原判定0抗原判定后，依次用相应的H因子血清检查第一相和第二相抗原与Hd因子血清凝集。（3）Vi抗原检查新分离的伤寒杆菌有Vi抗原，能与Vi血清凝集。一、标本采集、运送、包装、保存、接收可采用便盒留便、肛拭或采便管采便。便盒留便：留取粪便时应采集新鲜粪便的脓血部分、粘液部分、水样便
13、或稀便。便量15g。集体腹泻或食源性暴发患者粪便采集的数额，应根据患者人数的多少，决定采取标本的数量。当怀疑患者为菌血症时，应以无菌操作，从静脉血管采取1015mL血液，放入加有EDTA抗凝剂瓶中送检。所采取的粪便标本应尽快送检，不得超过2h送到化验室，否则标本应放入Cary-Blair运送培养基运送培养基中，运送时间超过2h者，应在冰浴条件下送检。送交分型分析菌株的接收要求：1)经过分纯的没有污染的菌株;2)分离菌株应该用甘油半固体保存；3)与分离菌株相对应的患者的临床症状和流行病学资料；4)经血清和生化证实为志贺菌。痢疾检验程序痢疾检验程序二、粪便标本志贺菌的分离方法1、分离方法（1）用接
14、种环多点沾取标本病变部分，直接划线分离于SS、EMB（或HE、麦康凯）琼脂平板。37培养24h。（2）血液培养将采取的抗凝血液标本，放入葡萄糖肉汤，37培养，逐日观察结果。一般13d内阳性较高。为提高阳性检出率，可以在标本中加入0.5mLOP乳化剂（聚乙二醇辛基苯基醚），使血球溶解，以提高阳性检出率。（3）挑选可疑菌落从37培养1624h的分离培养基上，观察挑选可疑菌落，其形态为无色，半透明，圆形，湿润、光滑、突起，大小为12mm；挑选可疑菌落，接种TSI和葡萄糖半固体或综合培养基，先划线后穿刺，做好标记，放37培养16h以上，观察结果2、初步生化反应志贺菌属在TSI上的生化反应为：斜面红色，
15、底层产酸黄色，不产气。在葡萄糖半固体管内产酸为黄色，不产气，无动力。在综合培养基上为：斜面红色中立段产酸黄色，底层绿色，无动力，福氏志贺菌6型在上述三种培养基中，有时可产生少量气体。3、生化学鉴定（1）凡属志贺氏菌属的培养物，应符合表Al所列的生化特性。（2）志贺菌属分为四个生化群。血清学分型与生化反应不一致者，均为非志贺菌。（3）生化反应或血清学反应可疑的培养物，均应做革兰氏染色镜俭，并加做V.P、苯丙氨酸、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸和葡萄糖n铵试验,与有关的细菌相鉴别。肠出血性大肠杆菌O157：H7的检验程序 粪便或其它标本 增菌6小时左右 磁珠浓缩 山梨醇麦康凯 培养基培养18-24小时可疑
16、菌落革兰氏 生化 血清学 毒力因子染色 反应 鉴定 鉴定*根据结果判定* 有条件的单位可进行如用PCR检测SLT1 、SLT2、Hly、EAE的基因 【注】1、培养及增菌均在37进行；2、山梨醇-麦康凯培养基中应加入适当的抑菌剂；3、“科玛嘉”培养基加入亚碲酸钾后选择效果更好；4、在SMAC中加入下列抑制剂的一种均可增加培养基的选择性；1）亚碲酸钾2.5mg/l和先锋霉素类抗生素Cefixime0.05mg/l；2）新生霉素10mg/l；3）万古霉素40mg/l；5、在科玛嘉或S-MAC平板上挑选可疑菌落与O157诊断血清、H7血清或O157单克隆抗体作试探性凝集试验，若不凝集，但临床表现疑为
17、EHEC感染，则应做如下处理。因为个别肠出血性大肠杆菌O157：H7具有K抗原，应在生化反应确定为大肠杆菌后用生理盐水制备菌悬液，并100水浴加热10-15分钟再与O157诊断血清或O157单克隆抗体做凝集试验。6、当生化反应和血清学反应结果均与肠出血性大肠杆菌O157：H7符合时，才能确认为肠出血性大肠杆菌O157：H7。7、目前许多国家使用的O157和H7特异性抗体与及少数细菌具有不同程度的交叉反应，如美国、法国还有我国自己生产的试剂都与弗劳地枸橼酸杆菌有交叉反应，因此，用生化试验确定为大肠杆菌是必须的,最为重要的是硫化氢试验。绝大多数肠出血性大肠杆菌菌株在24小时内不的发酵D-山梨醇。但
18、是，也报道了一些能够快速发酵D-山梨醇的菌株。8、典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：1）动力试验葡萄糖麦芽糖甘露醇蔗糖硫化氢尿素试验+/2）靛基质甲基红V-P试验枸橼酸盐苯丙氨酸脱氨酶3）赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶氧化酶氰化钾+/+/PCR在感染性疾病病原体在感染性疾病病原体检测中的应用检测中的应用u 病毒的检测病毒的检测o 定量定量o 定性定性o 基因型及基因突变基因型及基因突变u 细菌及其它微生物的检测细菌及其它微生物的检测o 难培养菌难培养菌o 耐药基因耐药基因u 寄生虫的检测寄生虫的检测手足口病的实验室检测方法手足口病的实验室检测方法u病毒分离病毒分离 采集的样本经过相应处理后接种于相
19、应细胞，进行肠道病毒采集的样本经过相应处理后接种于相应细胞，进行肠道病毒的培养，通过观察细胞毒性变化来判断是否感染肠道病毒。的培养，通过观察细胞毒性变化来判断是否感染肠道病毒。u测定人双份血清标本的中和抗体滴度测定人双份血清标本的中和抗体滴度 用用急急性性期期血血清清与与恢恢复复期期血血清清滴滴度度进进行行比比较较，抗抗体体滴滴度度4倍倍或或4倍以上增高证明病毒感染。倍以上增高证明病毒感染。u核酸检测核酸检测 主要是逆转录主要是逆转录-聚合酶链反应（聚合酶链反应（RT-PCR） 普通普通PCR和荧光定量和荧光定量PCR手足口病检测o待检标本类型及检测方法待检标本类型及检测方法编号编号检测方法检测方法标本类型标本类型1病毒分离病毒分离粪便、脑脊液、疱疹液和咽粪便、脑脊液、疱疹液和咽拭液拭液2双份血清标本的中和抗体双份血清标本的中和抗体滴度滴度血清、脑脊液血清、脑脊液3核酸检测（核酸检测（RT-PCR)血清、粪便、脑脊液、疱疹血清、粪便、脑脊液、疱疹液和咽拭液液和咽拭液PCR实验室布局细菌药敏试验o纸片扩散法纸片扩散法o稀释法稀释法o抗生素浓度梯度法抗生素浓度梯度法o自动化仪器法自动化仪器法
