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1、 NR2BNR2B在小鼠骨癌痛中的作用及在小鼠骨癌痛中的作用及机制研究机制研究 中南大学湘雅三医院 黄 东 教授 目前，全球癌症患者的数量呈 骨癌痛的具体机制 癌性疼痛成为影响癌症病人生活 质量的一个严重问题。 在癌痛中又以骨癌痛最为严重和最难以控制。+临床上，癌痛表现为进行性加重，常伴随有爆发痛；+癌痛与炎性痛和神经病理性痛存在着不同的外周和中枢机制1 。 如癌痛：胶质细胞增生肥大；GFAP 1 : Honore P. Neuroscience, 2000, 98: 585598. NMDA受体活化是反复伤害性刺激诱发中枢敏化 的基础，是持续性疼痛产生和维持的关键 2 。 大量研究证实：NM
2、DA受体的亚基NR2B在炎性痛、 神经病理痛中参与了伤害性信息传递，在疼痛调 制及痛觉敏化 的形成和维持中发挥重要作用 3 。2 : Petrenko. Anesth Analg. 2003, 97(4): 1108-1116. 3 : Nagy GG. Eur J Neurosci, 2004, 20 (12): 3301 - 3312.（一）（一） 研究显示，MAPK信号通路在神经可塑性和炎症 反应的细胞信号转导过程中起重要作用4 。 增生肥大的星形胶质细胞能释放大量胶质纤维酸 性蛋白（GFAP），骨癌痛的产生和维持与脊髓 星形胶质细胞结构和功能的变化密切相关1 。4 : De Leo J
3、A. Pain, 2006, 122 (122): 17221. （二）（二）研究癌痛的确切机制，需要适当的动物模型，现有动物模型仍显不足。肺癌是临床骨转移较多见的一种肿瘤，且小鼠在肿瘤 学及神经系统研究方面具有独特的优势。小鼠作为实验模型，较经济适用本实验参照Schwei等的方法，将Lewis肺癌细胞接种 于C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，建立一个全新的骨癌痛 模型。我们从如下四个方面加以研究：1、建立一个小鼠骨癌痛新模型2、NR2B在骨癌痛小鼠前扣带回和脊髓中的分 布与表达3、脊髓NR2B基因沉默对小鼠骨癌痛的影响4、MAPK信号通路介导的NR2B在小鼠骨癌痛中 的作用机制 实施方案：检测癌
4、痛小鼠脊髓和前扣带回NR2B的表达和分布，分析小鼠NR2B的表达和小鼠疼痛行为学关系。应用RNA干扰技术，沉默骨癌痛小鼠NR2B基因；通过对比干扰组小鼠与癌痛组小鼠NR2B的表达以及两组小鼠疼痛行为学，从而阐明NR2B是否在癌痛的发生与维持中起重要作用。对比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后，MAPK 信号通路及其介导的下游信号分子表达的相应改变；研究MAPK 信号通路中信号分子表达的相应改变与GFAP的关联性；探索MAPK信号通路在小鼠骨癌痛中的可能作用机制。选用清洁级雄性选用清洁级雄性C57BL/6小鼠小鼠模型组模型组一般情一般情况观察况观察行为学行为学测定测定内容内容1技术路线技术路线热灭活
5、组热灭活组PBS组组正常对照组正常对照组放射学放射学检查检查组织学组织学检测检测自发痛行自发痛行为观察为观察机械性触机械性触诱发痛诱发痛选用清洁级雄性选用清洁级雄性C57BL/6小鼠小鼠癌痛组癌痛组一般情一般情况观察况观察行为学行为学测定测定内容内容2技术路线技术路线假手术组假手术组正常对照组正常对照组实时定量实时定量PCR检测检测NR2B的的表达表达免疫组化检测免疫组化检测NR2B的表达的表达及分布及分布自发痛行自发痛行为观察为观察机械性触机械性触诱发痛诱发痛Western Blot检测检测NR2B的的表达表达选用清洁级雄性选用清洁级雄性C57BL/6小鼠小鼠癌痛组癌痛组一般情一般情况观察况
6、观察行为学行为学测定测定内容内容3技术路线技术路线干扰组干扰组干扰对照组干扰对照组实时定量实时定量PCR检测检测NR2B的的表达表达自发痛行自发痛行为观察为观察机械性触机械性触诱发痛诱发痛Western Blot检测检测NR2B的的表达表达选用清洁级雄性选用清洁级雄性C57BL/6小鼠小鼠正常组正常组一般情一般情况观察况观察行为学行为学测定测定内容内容4技术路线技术路线干扰组干扰组干扰对照组干扰对照组实时定量实时定量PCR检测检测NR2B、SP、c-fos和和GFAP基因基因的的表达表达自发痛行自发痛行为观察为观察机械性触机械性触诱发痛诱发痛Western Blot检测检测NR2B，p-ERK
7、，p-p38和和GFAP的表达的表达癌痛组癌痛组结结 果果1. 体重和一般状况体重和一般状况 图1：观察期内各组小鼠体重的变化2.行为学测试行为学测试 图2：自发痛行为观察 图3：机械性触诱发痛测定 3. 放射学检测放射学检测图4：模型组小鼠不同时间段术侧股骨X片结果: A为肿瘤细胞接种前摄片；B为接种后第7天； C为接种后第15天；D为接种后第23天。4.组织学观察组织学观察 骨髓腔内可见较多肿瘤细胞骨髓腔内大量肿瘤细胞浸润且骨小梁破坏肿瘤细胞侵犯周围肌肉骨髓腔破坏，肿瘤细胞穿破骨组织A:接种第7天模型组小鼠股骨切片 B:接种第15天模型组小鼠股骨切片C:1接种第23天模型组小鼠股骨切片 C
8、2:接种第23天模型组小鼠股骨 周围肌肉组织病检结果图6：模型组小鼠术侧股骨下段不同时间段的HE染色（HE400）行为学、放射学、组织学三方面证实： C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接种Lewis肺癌细胞，能成功制备小鼠骨癌痛模型，且此模型稳定、重复性好，与人类骨癌痛高度相似。 本研究我们首次选用来源广泛、致瘤作用强的 Lewis肺癌细胞，接种于C57BL/6小鼠股骨骨髓 腔，建立了一个新的小鼠骨癌痛模型。5、实时荧光定量PCR检测前扣带回和脊髓NR2B的表达前扣带回NR2B的表达前脑扣带回NR2BmRNA 相对表达量脊髓NR2B的表达图5：脊髓NR2BmRNA 相对表达量第14天前扣带回NR2B
9、的表达 A癌痛组前扣带回100倍； B癌痛组前扣带回区域200倍 C正常组前扣带回100倍； D正常组前扣带回区域200倍 E假手术组前扣带回100倍；F假手术组前扣带回区域200倍6、 免疫组化检测前扣带回和脊髓NR2B的表达前脑扣带回NR2B的表达 L4-L6脊髓NR2B的表达L4-L6脊髓NR2B的表达（200倍）术后第14天，L4-L6脊髓NR2B的表达术后第18天，L4-L6脊髓NR2B的表达癌痛组假手术组正常组癌痛组假手术组正常组L4-L6脊髓NR2B的分布 癌痛组 正常组 假手术组 L4-L6脊髓NR2B的分布（接种后14天）脊髓各层NR2B表达量在中央导水管、背角浅层、前角依次
10、增多7、Western Blot检测L4-6段脊髓NR2B的表达* 术后第14天各组小鼠脊髓NR2B 术后第18天各组小鼠脊髓NR2B的表达，A: 癌痛组B: 假手术组C: 正常组 的表达，A: 癌痛组B: 假手术组C: 正常组* 1、癌痛组小鼠脊髓和前扣带回中NR2B表达均明显增加，脊髓各层表达量由大到小依次为前角、背角浅层、中央导水管周围；且癌痛组NR2B表达上调的同时，疼痛行为学也有相应的改变。初步表明脊髓和前扣带回中的NR2B表达增加与小鼠骨癌痛产生和维持存在一定相关性。 2、同一癌痛模型中观察到NR2B在脊髓和前扣带回同时高表达，提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢，而且有
11、脑部中枢的参与。 3、本研究初次发现NR2B在脊髓前角细胞表达呈强阳性，为下一步研究提供了新的思路。图3：癌痛组、干扰组和干扰对照组小鼠脊髓NR2BmRNA的相对表达量8、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓L4-6节段NR2B的表达9、Western Blot检测小鼠脊髓L4-6节段NR2B的表达 Western Blot检测接种术后第14天 小鼠脊髓L4-6节段NR2B的表达 A:干扰组；B:干扰对照组；C:癌痛组NR2BGAPDHA B C* Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓L4-6节段NR2B的表达 A:干扰组；B:干扰对照组；C:癌痛组NR2BGAPDH*1、 PEI
12、/NR2B-siRNA复合物鞘内注射后能使骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表达下调；2、骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表达下调与小鼠疼痛行为学减轻相一致，进一步证明NR2B在癌痛发生过程中起重要作用，可能是癌痛治疗的有效靶点。10、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓NR2B、SP、 c-fos和GFAP基因的表达接种术后第14天，实时荧光定量PCR检测各组小鼠脊髓NR2B、SP、GFAP、c-fos的相对表达量 注：图示中NR2B组放大100倍，c-fos放大10倍11、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓NR2B、SP、 c-fos和GFAP基因的表达接种术后第18天，实时荧光定量PCR检测各组小鼠脊髓NR2B
13、、SP、GFAP、c-fos的相对表达量 注：图示中NR2B和c-fos组均放大100倍 图5：Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓NR2B的表达 A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组*图6：Western Blot检测接种术后第14天 小鼠脊髓p-ERK的表达A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组3.1 接种术后第14天，检测NR2B和p-ERK蛋白表达 NR2B GAPDHp-ERKGAPDH*12、Western Blot检测接种术后第14天小鼠脊髓的NR2B，p-ERK ，p-p38和GFAP蛋白表达 Western Blot
14、检测接种术后第14天 小鼠脊髓p-p38的表达 A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组* Western Blot检测接种术后第14天 小鼠脊髓GFAP的表达A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组*13、接种术后第14天，检测p-p38和GFAP蛋白表达GAPDHGFAP GAPDHWestern Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓NR2B的表达 A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓p-ERK的表达A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组 接种术后第18天，
15、检测NR2B和p-ERK蛋白表达14、 Western Blot检测接种术后第18天小鼠脊髓的NR2B，p-ERK ，p-p38和GFAP蛋白表达NR2BGAPDH p-ERK GAPDH*Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓p-p38的表达 A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓GFAP的表达A: 正常组；B: 癌痛组；C: 干扰组；D: 干扰对照组接种术后第18天，检测p-p38和GFAP蛋白表达 p-p38 GAPDH GFAP GAPDH*1）癌痛小鼠的MAPK通路中相应信号分子p-ERK、p-
16、p38、c-fos表达明显上调；而NR2B的沉默可以下调MAPK通路中相应信号分子p-ERK、p-p38、c-fos表达；2）GFAP在癌痛小鼠中高表达，同时NR2B的调控可以影响GFAP的表达；解除Mg2+ 对NMDA受体离子通道的阻断作用结合到突触后膜上配体门控离子型谷氨酸受体AMPA受体，Na+内流NMDA受体激活，Ca2+内流增加激活ERK，p38c-fos转录因子激活NR2B表达伤伤害性信号害性信号传传入脊髓背角，入脊髓背角，释释放大量谷氨酸放大量谷氨酸SP表达神经元下游相关基因表达变化神经胶质细胞GFAP表达结合到胶质细胞上AMPA受体激活ERK，p38直接导致胶质细胞内的GFAP
17、大量表达导导致癌痛致癌痛我们推测癌痛产生的可能机制我们推测癌痛产生的可能机制结结 论论1. C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接种Lewis肺癌细胞能成功制备小鼠骨癌痛新模型，此模型与人类骨癌痛具有相似性；2. NR2B在小鼠骨癌痛模型中呈高表达，且同一癌痛模型中观察到NR2B在L4-L6段脊髓和前扣带回同时高表达，提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢，而且有脑部中枢参与；3. 本研究初次发现NR2B在癌痛模型的L4-6段脊髓前角细胞表达呈强阳性，为下一步研究提供了新的思路；结结 论论4. PEI/NR2B-siRNA复合物能特异性的使骨癌痛小鼠脊髓 NR2B的表达明显下调；其表达下调与小鼠疼痛行为学减轻相一致，进一步证明NR2B在骨癌痛发生过程中起重要作用；5. MAPK信号转导通路（ERK通路和p38通路）在骨癌痛小鼠模型中被激活；NR2B参与了MAPK信号通路介导的骨癌痛的中枢敏化；6. NR2B参与介导的骨癌痛可能与GFAP的过表达相关，其机制有待进一步研究。
