《生物化学与分子生物学课件：实验六、底物浓度及抑制剂对酶促反应的影响2》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学与分子生物学课件：实验六、底物浓度及抑制剂对酶促反应的影响2（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验六实验六Km值测定和值测定和S、I 对酶活性的影响对酶活性的影响一、实验原理一、实验原理 米氏方程和双倒数作图米氏方程和双倒数作图 Km：V达到达到Vmax的一半时的底物浓度。的一半时的底物浓度。 Km是酶的特征常数之一，只与酶的结构、底物性质是酶的特征常数之一，只与酶的结构、底物性质以及反应条件以及反应条件(如温度、如温度、pH、离子强度等、离子强度等)有关，而与有关，而与酶浓度无关。酶浓度无关。 l双倒数作图法双倒数作图法lLinweaverBurk将米曼公式作双倒数处理得到一个直线方程，以1/S为横座标，1/V为纵座标作图可以得到一条直线。直线在纵轴的截距为l/Vm，在横轴上的截距为
2、-l/Km。抑制剂抑制剂 无抑无抑制剂制剂1/V 1/S 抑制剂抑制剂1/V 1/S 无抑制剂无抑制剂 抑制剂抑制剂 1/V 1/S 无抑制剂无抑制剂 l三种抑制类型的Vm、Km的变化：竞争性抑制非竞争性抑制 反竞争性抑制Vm不变降低降低Km增大不变减小 反应原理 ALP在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解释放出酚和磷酸；酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经K3Fe（CN)3氧化形成红色醌类化合物，根据红色深浅确定ALP的活力。 l 磷酸盐对碱性磷酸酶活性的抑制作用：磷酸盐对碱性磷酸酶活性的抑制作用： l抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的总称。l本实验观察Na2HPO4对ALP的作
3、用，通过测定不同底物浓度时ALP的活性，然后绘制1S1V曲线判断Na2HPO4对于ALP水解磷酸苯儿钠是属于竞争性、非竞争性或反竞争性抑制剂。二、操作二、操作1.米氏常数测定米氏常数测定 按下表操作： 0 1 2 3 4 5 底物溶液(0.02mol/L) 0.2 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8蒸馏水 0.8 0.7 0.6 0.5 0.3 0.1CBS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0ALP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀 37 15min（准确计时）铁氰化钾溶液 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混合，波长510nm，“0”管调零，读取各管吸
4、光度A510S（mmol/L) 2 3 4 6 8lS 1/2 1/3 1/4 1/6 1/81/ A5102、抑制剂对酶促反应的影响、抑制剂对酶促反应的影响 按下表操作： 0 1 2 3 4 5 底物溶液 0.2 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8蒸馏水 0.7 0.6 0.5 0.4 0.2 0磷酸氢二钠 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1CBS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0ALP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀 37 15min（准确计时）铁氰化钾溶液 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀 ，波长510nm，“0”管调零，读取各管吸光度A510S 2 3 4 6 8lS 1/2 1/3 1/4 1/6 1/81/ A5103、双倒数作图l以上两次结果在同一坐标纸上作图；l纵轴应画在坐标纸的中间；l以l/S为横坐标、1/ A510为纵坐标在直角坐标纸上绘制直线，分别求出两次的Km、Vm值l 1/A1/s4、结果计算： 无抑制剂Km： 有抑制剂Km： 结果分析：l结论：1、ALP水解磷酸苯二钠的Km；l 2、Na2HP04对于ALP水解磷酸苯二钠的抑制属于 抑制。
