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1、L/O/G/O 光合色素的提取、理化性质光合色素的提取、理化性质 分离、吸收光谱及含量的测定分离、吸收光谱及含量的测定模块二模块二 模模 块块 实实 验验7/29/2024实实 验验 背背 景景7/29/2024Caution!I 光合色素的提取与理化性质光合色素的提取与理化性质7/29/2024I 光合色素的提取与理化性质光合色素的提取与理化性质7/29/2024实验目的实验目的 掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。实验原理实验原理光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等
2、。提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。叶绿素分子中叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。等离子所取代。I 光合色素的提取与理化性质光合色素的提取与理化性质7/29/2024实验仪器及药品实验仪器及药品材料：材料：小桐子叶片小
3、桐子叶片方法及步骤方法及步骤 光合色素的提取光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石和石英砂英砂及及5 ml丙酮，充分研磨，再加入丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。I 光合色素的提取与理化性质光合色素的提取与理化性质7/29/2024观察观察荧光现象荧光现象：与光线：与光线垂直的方向观察色素颜垂直的方向观察色素颜色。色。光破坏作用光破坏作用：1ml色素色素提取液于室内，提取液于室内，1
4、ml于于太阳光下，太阳光下，30min后观后观察颜色变化。察颜色变化。I 光合色素的提取与理化性质光合色素的提取与理化性质7/29/2024皂化反应皂化反应：取一支试管，加入色素提取液：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入，再加入30%KOH甲醇溶液甲醇溶液1ml，摇，摇匀，再加入苯匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。注意观察整个过程颜色的变化。取代反应：取代反应：取一支试管，加入取一支试管，加入3ml色素，色素，逐滴加入逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。醋酸直
5、至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。上加热，与另一半比较颜色的差异。I 光合色素的提取与理化性质光合色素的提取与理化性质7/29/2024吸收光谱的变化：吸收光谱的变化：皂化和取代反应后的色素进行吸收光谱皂化和取代反应后的色素进行吸收光谱分析（见分析（见II）。）。结果与讨论结果与讨论 1、认真记录观察到的结果（、认真记录观察到的结果（颜色变化？分几层？为什么颜色变化？分几层？为什么？），并加以讨论。），并加以讨论。 思考题思考题 1、为什么在皂化反应中只能用、为什么在皂化反应中只能用20%KOH甲醇溶液，而
6、不甲醇溶液，而不能用能用20%KOH水溶液？水溶液？I 光合色素的提取与理化性质光合色素的提取与理化性质7/29/2024实验目的实验目的 掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。实验原理实验原理光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。等。不同光合色素的不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度分子量、分子结构、极性、溶解度、支持、支持物对它们的物对它们的吸附力吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。以分开。叶绿素的卟啉环结构对光有很强
7、的吸收，主要是叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝红光和蓝紫光紫光。II 光合色素的分离与吸收光谱光合色素的分离与吸收光谱7/29/2024实验仪器及药品实验仪器及药品材料：材料：菠菜叶片菠菜叶片方法及步骤方法及步骤 光合色素的提取光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取取1/3片叶片，放入研钵中并加入片叶片，放入研钵中并加入少许少许CaCO3和石和石英砂英砂及及5 ml丙酮，充分研磨，再加入丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。II 光合色素的分离与
8、吸收光谱光合色素的分离与吸收光谱7/29/2024光合色素分离：光合色素分离： 剪取适当长度和宽度的滤纸条剪取适当长度和宽度的滤纸条 用上行纸层析法分离色素用上行纸层析法分离色素 启动启动剂：石油醚：丙酮：苯剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。启动剂启动剂II 光合色素的分离与吸收光谱光合色素的分离与吸收光谱距离距离7/29/2024吸收光谱的测定：吸收光谱的测定：光合色素的吸收光谱光合色素的吸收光谱：取色素溶液：取色素溶液1 mL，加入丙，加入丙酮酮3 mL，摇匀后在分光光度计上，摇匀后在分光光度计上400到到700 nm处处每隔每隔10 nm进行扫描。进行扫描。各色素的吸收光谱各色素的吸收
9、光谱：上述层析出的：上述层析出的34种色素，种色素，分别剪下后溶于分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描。丙酮中，按上述方法扫描。II 光合色素的分离与吸收光谱光合色素的分离与吸收光谱7/29/2024结果与讨论结果与讨论 1、画出你的层析结果，并加以分析。、画出你的层析结果，并加以分析。 2、总光合色素和各光合色素的吸收光谱有何不同，为什、总光合色素和各光合色素的吸收光谱有何不同，为什么？么？思考题思考题 1、光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？、光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？2、试论述高等植物光合色素的种类和生理功能、试论述高等植物光合色素的种类和生理功能I
10、I 光合色素的分离与吸收光谱光合色素的分离与吸收光谱7/29/2024III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/2024K652 = 34.5III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/2024实验目的实验目的 掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。实验原理实验原理 混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠重叠，仍然可以根据，仍然可以根据Lambert-Beer定律（定律（A = k L C）求出各）求出各组分含量。组分含量。Lambert定律：定律：A = k L；
11、Beer定律定律A = k C。叶。叶绿素绿素a、b在在80%丙酮溶液中的丙酮溶液中的Amax分别为分别为663nm、645nm，由此得出：由此得出：见推导过程见推导过程 Ca = 12.7 A663 2.69 A645；Cb = 22.9 A645 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645实验仪器及药品实验仪器及药品实验材料：植物叶片实验材料：植物叶片III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/2024A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1 A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2 分光光度计测出，故分光光度计测出，故求二元一次方程组
12、可得到此公式求二元一次方程组可得到此公式。k比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度度(C)为为1g/L(0.1%)，比色皿的直径，比色皿的直径(光径，光径，L)为为1cm时所测时所测出的吸光度即为比吸收系数。故其单位为：出的吸光度即为比吸收系数。故其单位为：摩尔吸收系数。摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度的浓度(C)为为1mol/L，比色皿的直径，比色皿的直径(光径，光径，L)为为1cm时所测时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。故其单位为：出的吸光度即为摩尔吸收系数。故其单位为：由于由于
13、k是一个常数，而是一个常数，而A可以通过可以通过III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/2024方法及步骤方法及步骤方法一：快速测定法方法一：快速测定法 由于叶绿素由于叶绿素a、b在在652nm处有共同吸收，处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2方法二方法二: 分光光度计法分光光度计法色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知的叶圆的叶圆片片0.05g左
14、右，加入少许左右，加入少许CaCO3和石英砂及和石英砂及80%丙酮丙酮2ml，充分研磨，充分研磨，转入离心管中（转入离心管中（离心机使用离心机使用），再用），再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管丙酮洗研钵，转入离心管中，中，平衡平衡，5000rpm离心离心10min, 记录上清液体积，取记录上清液体积，取1ml稀释到稀释到4ml。测定：以测定：以1cm比色皿分别测定比色皿分别测定A663、A645。使。使A控制在控制在0.1 0.8之间。之间。III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/2024结果与讨论结果与讨论 1、根据原理中计算出三类色素的浓度（、根据原理中计算出三类色素的
15、浓度（mg / L）。）。2、根据公式、根据公式 分别计算出各种分别计算出各种植物叶片色素含量。植物叶片色素含量。思考题思考题 1、一般正常的植物叶片，、一般正常的植物叶片，Chla / Chlb = 3 / 1，你所测定的结果符合此比，你所测定的结果符合此比例吗？为什么？例吗？为什么？ 2、两种测定方法含量有何不同？为什么？、两种测定方法含量有何不同？为什么？ 3、怎样把方法一中的叶绿素含量、怎样把方法一中的叶绿素含量mg/dm2转换为方法二中的转换为方法二中的mg / g FW ？怎样测定不同形态的植物叶片的叶面积？怎样测定不同形态的植物叶片的叶面积？Chl content = (mg.g
16、-1FW)III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/2024附附1.叶面积的计算叶面积的计算选取单位面积重量是一个常数的打印纸如选取单位面积重量是一个常数的打印纸如A4或或16K。一。一般般A4打印纸为打印纸为70105GSM（g/m2）。）。用铅笔轻轻地沿着叶缘在用铅笔轻轻地沿着叶缘在A4纸上划线。纸上划线。用剪刀沿着叶缘剪下用剪刀沿着叶缘剪下A4纸。纸。称所剪下的称所剪下的A4纸的重量纸的重量W (g)。计算：计算：附附2.高速冷冻离心机的使用方法高速冷冻离心机的使用方法III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/2024温度调节温度调节1、插上电源插座、插上电源插座
17、2、按、按T接通电源接通电源3、按功能键调节温度上限、按功能键调节温度上限4、按功能键调节温度下限、按功能键调节温度下限5、按功能键显示目前温度、按功能键显示目前温度III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/20244、按功能键把Cd47改为Cd595、调节所需时间并确定1、按功能键显示、按功能键显示Cd002、Cd00改为改为Cd473、调节所需频率并确定、调节所需频率并确定6、按运行键、按运行键III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/2024III 光合色素含量的测定光合色素含量的测定7/29/2024模模 块块 实实 验验 报报 告告根据上述根据上述IIII部分的方法与结果，按基础性部分的方法与结果，按基础性实验报告或科技论文的形式写出模块实验实验报告或科技论文的形式写出模块实验报告。报告。7/29/2024
