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1、2010版版中国药典中国药典菌种的传代与保藏菌种的传代与保藏 广东药检广东药检陈睿陈睿2011年年8月月1. 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种生物检验等都有一套完整的菌种. .微生物具有生命活力，微生物具有生命活力，在传代过程中易发在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一项重要的基础工作，是微生物学基础生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一项重要的
2、基础工作，是微生物学基础工作的一项重要内容，也是药品微生物工作中的一项常用技术。工作的一项重要内容，也是药品微生物工作中的一项常用技术。 一、菌种保藏的意义一、菌种保藏的意义2. 如药品中的控制菌检查使用的阳性对照菌须防止因多次传代而使阳性对如药品中的控制菌检查使用的阳性对照菌须防止因多次传代而使阳性对照菌的典型生物学特征发生变化及菌株的死亡，保证达到菌种长期正确的形照菌的典型生物学特征发生变化及菌株的死亡，保证达到菌种长期正确的形态；态； 如药品微生物学检验过程中，检出的可疑致病菌须妥善保藏，以达到进一步鉴如药品微生物学检验过程中，检出的可疑致病菌须妥善保藏，以达到进一步鉴定的目的，保证用药
3、安全。定的目的，保证用药安全。3二、菌种代号的意义二、菌种代号的意义国内药品微生物检验所用的菌种代号是国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC（F）或）或 CMCC（B）CMCC 中国医学菌种保藏中心中国医学菌种保藏中心B 代表细菌，代表细菌， F 代表真菌。代表真菌。大肠杆菌大肠杆菌 CMCC (B) 44102乙型副伤寒沙门杆菌乙型副伤寒沙门杆菌 CMCC (B) 50094铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 CMCC (B)10104金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 CMCC (B)26003生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)980014三、常用菌种保藏方法三
4、、常用菌种保藏方法(一一) 菌种保藏的原理菌种保藏的原理根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。制微生物的代谢作用。低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。 5 选择保藏方法时，首
5、先应考虑方法能否长期地选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用,以提高保藏效果。以提高保藏效果。（二）菌种保藏步骤（二）菌种保藏步骤 挑选特征典型的纯菌菌落；挑选特征典型的纯菌菌落；确定保藏的合适菌体形态；确定保藏的合适菌体形态； 选择最适宜的保藏方法；选择最适宜的保藏方法；定定期期对对保保藏藏菌菌种种进进行行检检查查，观观察察是是否否发发生生变变化化，若若有有变变化化，须须改改变变保保藏藏方方法法。保藏期满应及时进行移种。
6、保藏期满应及时进行移种。61.1.琼脂斜面低温保存法琼脂斜面低温保存法 （1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4左右的冰箱中保藏。每隔左右的冰箱中保藏。每隔 23个月移种一次，继续进行保
7、藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年般可保藏半年 一年。有的甚至更长时间。一年。有的甚至更长时间。 （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。7大肠杆菌斜面大肠杆菌斜面 金黄色葡萄球菌斜面金黄色葡萄球菌斜面8 生孢梭菌生孢梭菌 白色念珠菌白色念珠菌需气菌、厌气菌培养基需气菌、厌气菌培养基 真菌培养基真菌培养基9各类菌种保藏条件及时间各类菌种保藏条件及时间菌菌种种培培养养基基保存温保存温度度传传种种时时间间细细菌菌一一般般多多用用于于营营养养琼琼脂脂或或根根据菌种规定选用培养基据菌种规定选用
8、培养基46芽芽孢孢杆杆菌菌36个个月月，其其它它细菌每个月细菌每个月酵母菌酵母菌一一般般用用麦麦芽芽汁汁琼琼脂脂或或麦麦芽芽汁酵母膏琼脂汁酵母膏琼脂46一般一般46个月个月丝状真丝状真菌菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等46每每4个个月月移移植植一一次次（每每2个月移植一次个月移植一次）10（3）特点：）特点：优点是优点是简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用。数微生物都适用。缺点是缺点是保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。11（4）注意事项：）注意事项：保藏
9、的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。 保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。 必必须须定定期期检检查查保保藏藏菌菌种种冰冰箱箱的的温温度度、湿湿度度以以及及菌菌种种管管的的棉棉塞塞是是否否松松动动或或生生霉霉，如有异常应及时处理。如有异常应及时处理。 每每次次移移植植后后，应应与与原原菌菌种种的的编编号号、名名称称逐逐一一核核对对，确确证证培培养养基基特特征征和和纯纯度度无无误误后再继续保藏。后再继续保藏。 保保藏
10、藏菌菌种种的的培培养养基基应应无无糖糖，其其他他菌菌类类含含糖糖小小于于 2 %为为宜宜，以以免免产产酸酸过过多多，影影响响菌种存活。菌种存活。 铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。 12 2、液体石蜡保存法：、液体石蜡保存法： 本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。（1）方法：）方法： 将将菌菌种种接接种种于于斜斜面面或或穿穿刺刺于于0.3 0.5 %琼琼脂
11、脂半半固固体体高高层层培培养养基基中中，培培养养好好备备用。用。取取化化学学纯纯的的液液体体石石蜡蜡装装在在试试管管中中，每每管管1015ml，加加棉棉塞塞，瓶瓶口口包包上上纸纸，121高高压压灭灭菌菌30min，取取出出置置37温温箱箱或或 110 170 烤烤箱箱中中 1 2 h 或或干干燥器内除去液体石蜡中的水分。燥器内除去液体石蜡中的水分。13 将将上上述述液液体体石石蜡蜡加加入入培培养养好好的的菌菌种种试试管管内内，液液体体石石蜡蜡液液面面以以高高出出培培养养基基最最上上端端 1 为为宜宜，将将试试管管直直立立，放放入入4冰箱中保藏。冰箱中保藏。适适用用范范围围：适适用用于于保保藏藏
12、部部分分霉霉菌菌，酵酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。 14液体石蜡对各类菌种保藏效果液体石蜡对各类菌种保藏效果菌菌种种菌株数菌株数保存时间（年）保存时间（年）存活率（存活率（%）细菌细菌霉菌霉菌酵母菌酵母菌放线菌放线菌87586400380552420.983.688.991.315（3）特点：）特点： 本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法， 该法主要使菌种与空气隔绝。该法主要使菌种与空气隔绝。（4）注意事项：）注意事项： 保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征
13、 后，方可进行保后，方可进行保藏。藏。 保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移种。需重新移种。 使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一 边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培 养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上 即可使用。即可使用。16将将沾沾有有少少量量液液体体石石蜡蜡的的接接种种针针浸浸于于95%酒酒精精中中片片刻刻，再再烧烧灼灼灭灭菌菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。以
14、免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。液液体体石石蜡蜡在在菌菌种种管管中中高高出出培培养养基基的的高高度度要要严严格格控控制制，如如太太多多，会会影影响响菌菌种种交交换换气气体体，使使保保藏藏效效果果不不好好；如如太太少少，斜斜面面容容易易干干燥燥，将将缩缩短短保保藏藏期。一般以高出斜面期。一般以高出斜面1为宜。为宜。制制备备无无菌菌液液体体石石蜡蜡时时，每每管管装装量量不不能能太太多多，否否则则分分装装到到菌菌种种培培养养基中易造成污染。基中易造成污染。173、半固体琼脂培养基（、半固体琼脂培养基（0.5%）4、40%甘油保存法甘油保存法： 18四、试验用菌种的培养传代方法四、试验
15、用菌种的培养传代方法程序：程序： 冻干菌复苏冻干菌复苏接种（斜面）接种（斜面） （菌种传代）（菌种传代）（营养肉汤）（营养肉汤） 制备菌悬液制备菌悬液 对照菌液对照菌液检定用标准菌种，由中国药品生物检定所提供，为冷冻干燥菌种。检定用标准菌种，由中国药品生物检定所提供，为冷冻干燥菌种。菌种的复苏与保存在专用无菌室或超净工作台内进行。菌种的复苏与保存在专用无菌室或超净工作台内进行。19 1菌种的复苏菌种的复苏 把冻干菌种管、灭菌把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。面数支，移入接种室或净化工作
16、台。先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。管封口一端，使骤冷而炸裂。 20 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取
17、1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置3537培养培养2224h。取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种呈典型菌落后，转种3代即可应用。如发现菌
18、型不典型，可进行平板分离单代即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。菌落。212 菌种的传代与保存菌种的传代与保存 方法（方法（1）：）： 菌斜面菌斜面 菌斜面（保存）菌斜面（保存） 培培养养基基应应新新鲜鲜制制备备，如如斜斜面面已已无无冷冷凝凝水水者者，不不宜宜再再使使用用。标标签签上上著著名名菌菌名名及及接接种种日日期期。至至冰冰箱箱取取出出的的菌菌种种斜斜面面，应应在在室室温温放放置置约约30分分钟钟，待待温温度度平平衡衡后后再再移移入入接种室或超净工作台。接种室或超净工作台。 点点燃燃酒酒精精灯灯，用用左左手手握握住住菌菌种种斜斜面面，将将管管口口靠靠进进火火焰焰旁旁，右右手
19、手拿拿接接种种棒棒后后端端，将将接接种种环环烧烧红红30秒秒，随随后后将将全全部部接接种种棒棒金金属属部部分分在在火火焰焰上上烧烧灼灼，往往返返通通过过3次次。左左手手将将管管口口在在火火焰焰上上旋旋转转烧烧灼灼，右右手手用用无无名名指指、小小指指及及掌掌部部夹夹住住棉棉塞塞，拨拨开开棉棉塞塞，将将接接种种环环伸伸人人管管内内先先在在近近壁壁的的琼琼脂脂斜斜面面上上靠靠一一下下，稍稍冷冷却却再再移移至至菌菌苔苔上上，刮刮去去少少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。22 堵堵上上棉棉塞塞，左左手手将将菌菌种种管管放放下下，取取营营养养琼
20、琼脂脂斜斜面面1支支，照照上上述述操操作作打打开开棉棉塞塞，将将接接种种环环伸伸入入管管内内至至琼琼脂脂斜斜面面的的低低部部，由由底底向向上上，将将接接种种环环轻轻贴贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。 取取出出接接种种棒棒，在在火火焰焰旁旁将将培培养养基基管管棉棉塞塞堵堵上上，然然后后将将接接种种过过细细菌菌的的接接种棒在火焰上烧灼灭菌。种棒在火焰上烧灼灭菌。 将将已已接接种种毕毕的的细细菌菌管管置置3537培培养养2224小小时时，霉霉菌菌管管一一般般置置2025霉霉菌菌培培养养箱箱内内培培养养7日日。取取出出后后放放人人冰冰箱箱保保存
21、存，一一般般 3个个月月转转种种一次。一次。23 方法方法2：菌斜面：菌斜面营养肉汤营养肉汤分离平板分离平板菌斜面菌斜面如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分离菌落）如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分离菌落）：用用接接种种环环取取上上述述菌菌管管（斜斜面面）菌菌苔苔少少许许接接种种置置营营养养肉肉汤汤中中(5ml/支支,已已灭灭菌菌),置置3537培培养养1824小小时时后后，再再用用接接种种环环取取培培养养好好的的营营养养肉肉汤汤菌菌悬悬液液（浓浓菌菌液液），接接种种于于分分离离平平板板，置置3537培培养养1824小小时时，用用接接种种针针选选典典型型菌菌落落划划线线于于营
22、营养养琼琼脂脂斜斜面面，置置3537培培养养1824小小时时。一一般般同同时时接接种种几几支支管管，其其中中一一支支用用于于以以后后菌菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种。种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种。24常用分离平板：常用分离平板：大肠埃希菌大肠埃希菌EMB琼脂平板琼脂平板25铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌溴化十六烷三甲铵琼脂培养基溴化十六烷三甲铵琼脂培养基26l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌甘露醇氯化钠琼脂培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基27l沙门菌沙门菌SS琼脂平板琼脂平板 283 菌悬液的制备菌悬液的制备 取取上上述述培培养养好好的的菌菌种种斜斜面面移移入入接
23、接种种室室或或净净化化工工作作台台，放放置置室室温温后后, 用用接接种种环环取取菌菌苔苔少少许许接接种种置置营营养养肉肉汤汤中中(5ml/支支,已已灭灭菌菌), 将将已已接接种种毕毕的的细细菌菌管管置置3537培养培养1824小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用7天。天。294 对照用菌液制备对照用菌液制备 取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）1ml，加到，加到9ml 0.9%无无菌氯化钠溶液混匀，为菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只吸管吸取，再取另一只吸管吸取10-1菌液菌液1 ml加到加到9ml 0.9%无菌
24、氯化钠溶液混匀，为无菌氯化钠溶液混匀，为10-2 以此类推，稀释至含活菌数在以此类推，稀释至含活菌数在 50 100 个。用平板计数。个。用平板计数。 此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在1天内使用。天内使用。30菌种菌种菌种菌种工作菌种培养基工作菌种培养基菌悬液菌悬液对照菌液对照菌液大肠杆菌大肠杆菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液沙门菌沙门菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液
25、铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液生孢梭菌生孢梭菌硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐培培养养基基硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐培培养养基基0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液白色念珠菌白色念珠菌真菌琼脂斜面真菌琼脂斜面真菌培养基真菌培养基0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液31五、菌种保管五、菌种保管 菌菌种种保保管管应应有有专专人人负负责责，保保存存与与加加锁锁的的冰冰箱箱中中或或特特制制的的白白铁铁箱箱中中加加锁锁置置阴阴暗处，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。暗处，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。 菌菌种种应应有有详详细细登登记记本本，包包括括名名称称、分分离离日日期期、鉴鉴定定日日期期、鉴鉴定定者者、主主要要鉴鉴定定性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。 各各种种菌菌种种应应按按规规定定时时间间定定期期移移种种。一一般般每每移移种种3次次后后作作一一次次全全面面鉴鉴定定。注注意意菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换。菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换。 购购置置菌菌种种，应应有有介介绍绍信信。全全部部保保存存菌菌种种应应具具备备清清单单，并并定定期期向向部部门门负负责责人人报告。报告。 3233
