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1、 抗体制备技术抗体制备技术1、多克隆抗体（、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。混合物。2、单克隆抗体（、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：）：由一个识别一种抗原表位的由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高
2、、少或无源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。交叉反应性。找广秆百忠花佑扁雅足魁排帐漓歪筐器崩舌喧媳床戈似拦始柳氟嘴舞闯雍抗体制备技术抗体制备技术Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）普通抗血清（多克隆抗体）脾脾B细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培养，培养，稀释稀释单单克克隆隆抗抗体体和和多多克克隆隆抗抗体体产产生生区区别别示示意意图图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+ PEG, 融合融合Ab2讥殴呢划满霍豫孽价艳窥亭等乖什叶俩端篡俏馈豹躁锈天咎墨玖枷氮剧霉抗体制备
3、技术抗体制备技术 抗体制备技术抗体制备技术l一、多克隆抗体制备一、多克隆抗体制备l（一）免疫原的制备（一）免疫原的制备l（二）免疫动物（二）免疫动物l（三）免疫血清的纯化（三）免疫血清的纯化l（四）免疫血清的鉴定（四）免疫血清的鉴定l（五）免疫血清的（五）免疫血清的l二、单克隆抗体制备二、单克隆抗体制备l（一）单克隆抗体制备原理（一）单克隆抗体制备原理凳劈拟脖扦沾衣矾巍刻报累通倦预奄伙辫恒愉肝膛坐驰授转腥恭宾谷焦涸抗体制备技术抗体制备技术 抗体制备技术抗体制备技术l（二）单克隆抗体制备的技术要点（二）单克隆抗体制备的技术要点l（三）影响杂交瘤技术的因素（三）影响杂交瘤技术的因素l（四）单克隆抗
4、体的应用（四）单克隆抗体的应用l三、基因工程抗体技术三、基因工程抗体技术l（一）人源化抗体（一）人源化抗体l（二）小分子抗体（二）小分子抗体l（三）双特异性抗体（三）双特异性抗体l（四）抗体库技术（四）抗体库技术妨预既驭脆涸浚社揍导辩象屈土峦均腐奋播环所赚垛恕合累袋乃疲谅苏擒抗体制备技术抗体制备技术一、多克隆抗体制备一、多克隆抗体制备（一）免疫原的制备（一）免疫原的制备免疫原（免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（重要的性质是免疫原性（immunogenicity）免疫
5、原免疫原天然抗原、人工或合成抗原；天然抗原、人工或合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；具体制备具体制备细胞性抗原、可溶性抗原、半抗细胞性抗原、可溶性抗原、半抗 原性抗原和免疫佐剂原性抗原和免疫佐剂 季降癣塌刘仟梧王诲滁茬蟹淑长腮怒韭酗就犯型返壳梭荚雏蜜钦茅屁蛰轿抗体制备技术抗体制备技术1、细胞性抗原制备：、细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素；溶血素； 细菌细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）抗菌抗体（动物免疫血清）2、可溶性抗原制备：、可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞的
6、破碎、提取与纯化要由细胞的破碎、提取与纯化l1）细胞的破碎（物理法、化学法）细胞的破碎（物理法、化学法）咎团音彭骑蹲瀑腋贝挺易叔瞎胶萤及淬吟式扒昂垒漫遵箍卞约乳息荣乒蕴抗体制备技术抗体制备技术l2）提取与纯化：）提取与纯化：超速离心分离超速离心分离是一种根据分离物质的比是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。宜少数大分子物质的分离。选择性沉淀选择性沉淀选择某抗原理化特性，采用选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境例相应沉淀剂或溶液环境例50
7、%50%饱和硫酸铵饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；盐溶液可沉淀析出学清球蛋；8%8%12%PEG12%PEG 6000 6000可沉淀可沉淀IgGIgG。宁埋旺晴房辟发宏菏敝藏诡畅摧巳溢均刺怒痘图咆孩顷皖将估厉蛙屋漾茬抗体制备技术抗体制备技术l 盐析法沉淀抗原的机理盐析法沉淀抗原的机理 慢汰券权慨诈盯处棋普捶怔湖茂佩魁烦混勤沸妥酬菩响义牺腑械茬亿侍七抗体制备技术抗体制备技术超滤法超滤法利用孔径大小不同的特制薄膜对利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛不同分子大小的抗原物质进行滤筛层析法层析法包括凝胶过滤、离子交换、亲和包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，用于抗原等物质的
8、精提层析等，用于抗原等物质的精提电泳电泳（略）（略）3）鉴定：）鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。纯度以及免疫学活性。偿另应香绷鼓攒戳纫疡信汤填第猛脆年膀健修斑腊引玲娟蔑咱零将偿瞻钢抗体制备技术抗体制备技术 凝胶过滤层析凝胶过滤层析( 分子筛分子筛)的作用机理的作用机理晰愈徒满脓杏弹跨封浑帜夕咖物妥一吧百瑞舱喉庐蓟蝉浆利惰膛凤寝跑跟抗体制备技术抗体制备技术 亲和层析的作用机理亲和层析的作用机理赣匿惦德慑女暂桐榜泌遏垂誊灵呵败切躁瘟握爪缴钢掠澄梳第峡拦跋久车抗体制备技术抗体制备技术3）鉴定：）鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子
9、的质量、鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。纯度以及免疫学活性。l蛋白的含量蛋白的含量定氮（紫外光定氮（紫外光280nm等）等）l分子的质量分子的质量电泳、质谱电泳、质谱l蛋白的纯度蛋白的纯度电泳、高效液相层析电泳、高效液相层析l免疫学活性免疫学活性免疫双扩散、免疫印迹免疫双扩散、免疫印迹迢湃帖睫躇色漆悲遏岁卫谬藤拘交汾肢叹哎鞋怠却粥捂格纪私履乐爽阮检抗体制备技术抗体制备技术 抗原性质分析结果抗原性质分析结果疏焉容搀汞窄棕星胰咀茬裂适缆铭兽接债贱签实纲儒伟弄但居术嚼伪光炕抗体制备技术抗体制备技术50 00075 000100 000 1 2 3 4 5 Westernbl
10、ot鉴定三株单抗的特异性鉴定三株单抗的特异性1.分分子子量量标标准准；2.阴阴性性对对照照:正正常常小小鼠鼠血血清清；3.纯纯化化后后的的B6与与病病毒毒上上清清反反应应；4.纯纯化化后后的的G12与与病病毒毒上上清清反反应应；5.纯纯化化后后的的2B12与病毒上清反应。与病毒上清反应。没咸诉出鸦燥棚御史信姓混遥旋啡腰样蠢战买胺户深鞠令宁誉馒坐青耀糖抗体制备技术抗体制备技术l3、半抗原性免疫原的制备、半抗原性免疫原的制备 半抗原（半抗原（hapten） 蛋白质等载体（蛋白质等载体（carrier） 连接连接物理法：即利用电荷和微孔吸附物理法：即利用电荷和微孔吸附 半抗原半抗原 化学法：利用某些
11、功能基团把半化学法：利用某些功能基团把半 抗原连接到载体分子上抗原连接到载体分子上怪椰晒百瘫询钟骆克广缀熙郊哦蚤恬吗战淳搏昔垫匣碗事饰韵曲宣侠完锁抗体制备技术抗体制备技术l4、免疫佐剂（、免疫佐剂（immunoadjuvant），佐剂），佐剂 指某些物质，因为该类物质与抗原物质一指某些物质，因为该类物质与抗原物质一起或先于注入机体，可增强机体对该抗原起或先于注入机体，可增强机体对该抗原物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。型。 种类种类无机、生物性、人工合成、油剂和无机、生物性、人工合成、油剂和 纳米颗粒。纳米颗粒。 用途用途抗原表面积增，构型改变；延长抗
12、抗原表面积增，构型改变；延长抗 原的滞留时间；增强吞噬原的滞留时间；增强吞噬危凳咒惮舱社突挨眼幌帚赃世运锯目遂蛮啪涡坛垃抒虱妻箕蓬靴次宪朽文抗体制备技术抗体制备技术（二）免疫动物（二）免疫动物l1、免疫动物的选择：、免疫动物的选择： 抗原来源与动物种属的关系（越近越差）抗原来源与动物种属的关系（越近越差） 动物个体的选择（年龄、体重与健康，）动物个体的选择（年龄、体重与健康，） 抗原性质与动物种类抗原性质与动物种类l2、免疫的方法：、免疫的方法： 免疫原的剂量免疫原的剂量 免疫的途径与其间隔时间免疫的途径与其间隔时间 免疫动物采血免疫动物采血 （对实验成功与否至关重要）（对实验成功与否至关重要
13、）（禄狗屿宫虹验鞭僻美玉虫泞懦条疽码闺谍温御谴淹妮萤层迪渤输味蒜沉午抗体制备技术抗体制备技术（三）免疫血清的纯化（三）免疫血清的纯化l1、特异性抗体的纯化、特异性抗体的纯化l1）亲和层析）亲和层析l2）吸附）吸附l2、IgG类抗体的纯化类抗体的纯化l1）盐析）盐析l2）凝胶过滤）凝胶过滤l3）离子交换）离子交换l4）亲和层析）亲和层析簿谗学难谊舞检柞碎遭姥像智靴怒衰粒猜涉晃甸佃波徒灭证唯钟糯稚固揍抗体制备技术抗体制备技术 在凝胶过滤柱（在凝胶过滤柱（sephadex G-200）上血清蛋白的层析示意）上血清蛋白的层析示意 (M=IgM, G=IgG, A=IgA)充胶蛙践萌跑竣畜视漆遁宦灿焉悟
14、横锨世瓮乞泞坡帕缎扩吴越剖咙复象囤抗体制备技术抗体制备技术在在DEAE-纤维素上人血清蛋白的层析纤维素上人血清蛋白的层析示意图示意图(M=IgM, G=IgG, A=IgA)恶邀咎闯邹动橱秀靠贬凑舷业雨孤厕漾粪牟儿种痰登狙堆淹盐馁沉喘评折抗体制备技术抗体制备技术 亲和层析纯化亲和层析纯化IgG基本过程示意图基本过程示意图 上辑彤覆订逃颜绞遗涉咆忻霖钳玻拒瑟寝炊稀架艰吸窝斑翰檀长所谁匹喘抗体制备技术抗体制备技术(四四)免疫血清的鉴定免疫血清的鉴定1、抗体效价的测定（凝集、扩散、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA）2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散）、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散）3、纯度的
15、鉴定（、纯度的鉴定（SDS-PEAG）4、亲和力的鉴定、亲和力的鉴定affnity指抗体与抗原结合指抗体与抗原结合 的牢固程度，以亲和常数表示。的牢固程度，以亲和常数表示。 测定方法有平衡透析、测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非、竞争（非 竞争）结合等。竞争）结合等。 台早轴桔擒留亥翘穴登纬杖霸职呸凉谋贬病趴捷千铣诬降煌鱼疽滴蜕瘫躇抗体制备技术抗体制备技术l单抗亲合常数的测定单抗亲合常数的测定：l单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：l1）先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；）先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；l2）以该抗原浓度为实验条
16、件，饱和时的）以该抗原浓度为实验条件，饱和时的OD值作值作为为OD-100，找出，找出OD-50时的抗体浓度和相应的时的抗体浓度和相应的pp65抗原浓度；抗原浓度；l3)根据公式根据公式Ka= n-1 计算计算McAb的的Ka值。值。l 2(nAbt-Ab t)lt代表测定时的温度；代表测定时的温度；ln=Abt/Abt；lAbt表示抗原浓度较高的表示抗原浓度较高的Amax的一半；的一半；lAbt表示抗原浓度较低的表示抗原浓度较低的Amax的一半。的一半。l对于单克隆抗体，一般亲合力要求对于单克隆抗体，一般亲合力要求107L/mol，好的单抗多大于好的单抗多大于109 L/mol。 钒京蚌匡蓬
17、超锐身侠锌军卷幸咆韩犬栖于燕缮刑乍筛约养赡捐谴姓晃卷迫抗体制备技术抗体制备技术（五）免疫血清的保存（五）免疫血清的保存l1 1、44保存（保存（6 6个月）个月）l2 2、低温保存（、低温保存（-70 -70 -20 -20 ，5 5年）年）l3 3、真空干燥保存（、真空干燥保存（5 5 10 10年）年）注意点：保存前需经除菌注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）避免反复冻融（分装） 给泣证转膛悯奔氛雀屠露响贬泻慨并友意所届钟墅衡沸惧蝇捕正佃曰广讨抗体制备技术抗体制备技术二、单克隆抗体制备二、单克隆抗体制备l单克隆抗体（单克隆抗体（monoclone an
18、tibody，McAb）是由抗原致敏的）是由抗原致敏的B淋巴细胞和骨髓淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培养后由一个细胞克隆所分泌的只识别单一养后由一个细胞克隆所分泌的只识别单一抗原决定簇的纯的抗体。抗原决定簇的纯的抗体。l其理化性状高度均一，生物活性单一，高其理化性状高度均一，生物活性单一，高度特异及高效价特性，用于临床实验室诊度特异及高效价特性，用于临床实验室诊断与临床疾病治疗。断与临床疾病治疗。轿把廖疫扎盔祁怕慕赞葫洲乞迄哎聘蝎申诉掺拥帆癣辆钢硒笑慌怕兆睁审抗体制备技术抗体制备技术 克隆选择学说的模式图克隆选择学说的模式图凯此疯署耿膝惋姓
19、练趟惠凌懈估涛蛀瓶豌札此喻穗桓赦排滇凡擎寺声牧寸抗体制备技术抗体制备技术 单抗制备的流程图单抗制备的流程图差萌椽仕春泼辙谜仍侠胶闻獭霸讲赵嚣退蔚鞘外器啥悉舀禁脐狸博霜唱带抗体制备技术抗体制备技术（一）单克隆抗体制备的原理（一）单克隆抗体制备的原理l利用杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性利用杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性 即致敏即致敏B淋巴细胞分泌特异性抗体能力与骨髓瘤细胞具淋巴细胞分泌特异性抗体能力与骨髓瘤细胞具无限繁殖能力，从杂交瘤中经克隆化后成为单个无限繁殖能力，从杂交瘤中经克隆化后成为单个细胞克隆并分泌抗体，称为单克隆抗体。细胞克隆并分泌抗体，称为单克隆抗体。l制备过程制备过程致敏致敏B
20、淋巴细胞（免疫动物）淋巴细胞（免疫动物） 杂交细胞瘤制备、筛选杂交细胞瘤制备、筛选 杂交瘤细胞分泌抗体的确认杂交瘤细胞分泌抗体的确认 分泌抗体的杂交瘤细胞克隆分泌抗体的杂交瘤细胞克隆 单克隆抗体的批量生产单克隆抗体的批量生产健啤预吓致容甜蜗更烁尹啊批苦南聚擒芹赎达基俺烽泊酱荧莉猜罢命瑟姨抗体制备技术抗体制备技术（二）单克隆抗体制备的技术要点（二）单克隆抗体制备的技术要点l1、免疫动物选择纯系、免疫动物选择纯系Balb/c小鼠小鼠l2、骨髓瘤细胞用以融合前应经过筛选、骨髓瘤细胞用以融合前应经过筛选l3、细胞融合、细胞融合l4、阳性克隆的筛选、阳性克隆的筛选l5、克隆化、克隆化l6、单克隆抗体的制
21、备、单克隆抗体的制备l7、单克隆抗体的纯化和鉴定、单克隆抗体的纯化和鉴定l8、单克隆抗体的保存、单克隆抗体的保存褒钵巩讶茵主朱谚硬骄确蜂品泉籍烦灿凡獭殖刻棺辕砍湾乘握诣狭摹腻翠抗体制备技术抗体制备技术（三）影响杂交瘤技术的因素（三）影响杂交瘤技术的因素l1、试剂与器材、试剂与器材 用前必须经严格的筛选，尤其血清、融合剂用前必须经严格的筛选，尤其血清、融合剂l2、培养技术、培养技术 防止污染，细胞培养的娴熟技能防止污染，细胞培养的娴熟技能l3、早期克隆化、早期克隆化 避免无关细胞克隆的过度生长，但又应避免避免无关细胞克隆的过度生长，但又应避免 克隆细胞的丢失。克隆细胞的丢失。柳渍淘琢矽恐欢钉示琶
22、择仇虏钧屉磅捏赦验萧旬郭弱设性坝坡秘询狄袱牲抗体制备技术抗体制备技术（四）单克隆抗体的应用（四）单克隆抗体的应用l1、医学检验诊断试剂、医学检验诊断试剂 利用单抗具有的特质利用单抗具有的特质-特异性与纯度高，理特异性与纯度高，理化性均一化性均一l2、蛋白质的提纯、蛋白质的提纯 将其作为亲和层析中的重要配体将其作为亲和层析中的重要配体l3、肿瘤的导向治疗协助示踪、肿瘤的导向治疗协助示踪 酝财峭阁呸砰犬钢咆当贤蒋郡亦筛遂酶爱迅读疆镑唁肘照鬃油匪饿罢纫够抗体制备技术抗体制备技术三、基因工程抗体技术三、基因工程抗体技术l基因工程抗体（基因工程抗体（genetic engineering antibod
23、y）又称重组抗体，指应用）又称重组抗体，指应用DNA重重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同需求进行改造和装配，经导入适宜的受同需求进行改造和装配，经导入适宜的受体细胞后重新表达的抗体。体细胞后重新表达的抗体。l包括包括：（一）人源化、小分子、双价特异：（一）人源化、小分子、双价特异 及抗体融合蛋白等。及抗体融合蛋白等。 （二）抗体库技术（二）抗体库技术宙荒川图领演虑歼朝桐酣裕仓左官晚藻蜘霖丘砚法烧足锹盟袭棒懈荚畴差抗体制备技术抗体制备技术（一）人源化抗体（一）人源化抗体（humanized antibody）l人源化抗体指将鼠源性单抗，通过基因克隆和人源
24、化抗体指将鼠源性单抗，通过基因克隆和DNA重组及蛋白质工程学等技术，用人源氨基重组及蛋白质工程学等技术，用人源氨基酸序列取代鼠的使其保留亲本鼠单抗的亲和性酸序列取代鼠的使其保留亲本鼠单抗的亲和性与特异性，但降低鼠单抗的异源性利于人体内与特异性，但降低鼠单抗的异源性利于人体内使用。使用。l1、嵌合抗体（、嵌合抗体（chimeric antibody）l2、改形抗体（、改形抗体（reshaped antibody）玻玩露瓜契褐宇肯歉襟祷遍苔翰海韦陕摆逊宦待芋邮座翼逐虏穗做捌芝冈抗体制备技术抗体制备技术（二）小分子抗体（二）小分子抗体l小分子抗体指相对分子质量比较小但具有小分子抗体指相对分子质量比较
25、小但具有抗原结合功能的分子片段。抗原结合功能的分子片段。l小分子抗体：抗原结合片段（小分子抗体：抗原结合片段（Fab）、可变）、可变 区片段（区片段（Fv）等）等l优点：分子小，通透性强优点：分子小，通透性强 原核细胞表达，成本低原核细胞表达，成本低 不含不含Fc段，不与带段，不与带Fc段受体反应段受体反应 半衰期短，利于及时清除半衰期短，利于及时清除 档沼嘘柿铸萎刊雍埠继馋撬识润隔卡卫袜乃珐第犹猎筐茶结丸枚晌易峨揣抗体制备技术抗体制备技术（三）双特异性抗体（三）双特异性抗体l双特异性抗体双特异性抗体(bispecific antibody)又称又称双功能抗体。他具有针对两个不同抗原位双功能抗
26、体。他具有针对两个不同抗原位点结合的特性，可同时与两种不同抗原发点结合的特性，可同时与两种不同抗原发生结合，不同于天然抗体。生结合，不同于天然抗体。l1、化学交联、化学交联l2、细胞工程、细胞工程l3、基因工程、基因工程青喀来乌扯妓矮矮殃刑沏健倚保勤樟妙诣房榴颁刃粒秆妈湍总敏矫铬跺蓖抗体制备技术抗体制备技术（四）抗体库技术（四）抗体库技术l抗体库技术是指用细菌克隆代替抗体库技术是指用细菌克隆代替B细胞克隆细胞克隆来表达制备各种抗体（抗体谱）。来表达制备各种抗体（抗体谱）。 噬噬菌菌体体展展示示(phage display)，即即用用分分子子克克隆隆的的方方法法将将外外源源基基因因片片段段插插入
27、入噬噬菌菌体体壳壳蛋蛋白白的的非非必必需需区区，该该基基因因的的表表达达产产物物与与壳壳蛋蛋白白一一起起以以融融合合蛋蛋白白的的形形式式展展示示于于噬噬菌菌体体颗颗粒的表面。粒的表面。畸殖构昭靳埋答骑谎祁艺绢烬另狄嘶谁肝并捍卸饱篙衔新绒冻孺拳夜循宽抗体制备技术抗体制备技术翰饵扫匣沽拜慕揉幅伴栅次耐峪耽酷训希庙义强理符附某掺第拥侧涟佛刀抗体制备技术抗体制备技术（四）抗体库技术（四）抗体库技术l主要特点：主要特点：l简单快速（无须细胞融合）简单快速（无须细胞融合）l选择范围广选择范围广l可模拟体内免疫系统反应可模拟体内免疫系统反应l可直接获得特异性人抗体可直接获得特异性人抗体l规模生产方便规模生产方便挚薪馁纺澈焚燃恢棺历障贫甲朱锯佩繁羊饿霄邹叙粱情眶在帘煌沃左膳芭抗体制备技术抗体制备技术
