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1、第四章第四章 分子生物学的研究方法分子生物学的研究方法1一、重组一、重组DNADNA技术技术理论上三大发现理论上三大发现技术上三大发明技术上三大发明遗传物质是遗传物质是DNADNA双螺旋结构双螺旋结构遗传信息传递方式遗传信息传递方式工具酶工具酶载体载体转录酶转录酶1973年年以以DNA重组实验成功为标志重组实验成功为标志现代分子生物学现代分子生物学跨越天然物种屏障跨越天然物种屏障定向创造新物种定向创造新物种2工具酶工具酶基因基因载体载体受体细胞受体细胞必要条件必要条件操作过程操作过程获得获得外源基因（目的基因外源基因（目的基因/ /目的片段）目的片段）与载体进行体外与载体进行体外重组重组形成重
2、组体（重组子）形成重组体（重组子）将重组体将重组体导入导入（转化（转化/ /转导转导/ /转染）受体细胞转染）受体细胞细细胞胞扩扩增增和和筛筛选选含含有有重重组组体体的的受受体体细细胞胞（宿宿主主细细胞胞/ /寄主细胞）寄主细胞）培养含有重组体的细胞（阳性克隆）培养含有重组体的细胞（阳性克隆）检测检测表达产物表达产物分、分、 切、切、 接、接、 转、转、 筛筛 + + 检检345工具酶工具酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶连接酶连接酶连接酶连接酶修饰酶修饰酶修饰酶修饰酶DNA聚合酶聚合酶 DNA Polymerase逆转录酶逆转录酶 Reverse TranscriptaseT
3、4多核苷酸酶多核苷酸酶 T4 Polymerase Kinase碱性磷酸酶碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase6活性定义活性定义限限制制酶酶的的一一个个活活性性单单位位（1U），原原则则上上是是在在50l的的反反应应液液中中，37的的温温度度条条件件下下，经经过过1小小时时反反应应，将将1gDNA完全分解所需要的酶量。完全分解所需要的酶量。特点特点 识识别别部部位位序序列列一一般般为为4、5或或6个个核核苷苷酸序列；酸序列；呈双重轴对称。呈双重轴对称。限制性内切酶限制性内切酶性质性质切切断断识识别别部部位位或或其其附附近近特特定定部部位位后后，产产生生两两种种末末端端，即即平平齐
4、齐末末端端和和粘粘性性末末端端（5突突出端和出端和3突出端）。突出端）。Pst ICTGCAGGACGTCEcoRI3突突出出5突突出出7特殊的限制酶特殊的限制酶同裂酶同裂酶isoschizomer指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。 同尾酶同尾酶isocaudamer指识别序列不同，但切割指识别序列不同，但切割DNA后可以产生相同粘端的后可以产生相同粘端的限制性内切酶。限制性内切酶。8DNA连接酶可以催化单链连接酶可以催化单链DNA的连接吗？的连接吗？DNA连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？连接
5、酶连接酶9主要连接酶的功能特点主要连接酶的功能特点最常用连接酶最常用连接酶T4DNAlingaseE.coli.DNAlingase平齐末端双链平齐末端双链DNA分子的连接分子的连接功能功能有有无无匹配粘性末端双匹配粘性末端双链链DNA分子的连分子的连接功能接功能有有有有辅助因子辅助因子ATPNAD+10p载体和插入片段载体和插入片段具有相同的粘性末端具有相同的粘性末端具有相同的粘性末端具有相同的粘性末端容易连接成环状的重组容易连接成环状的重组DNADNA分子分子可能出现问题：可能出现问题：载体自身环化载体自身环化，造成假阳性背景克隆；，造成假阳性背景克隆；插入片段可插入片段可双向插入双向插入
6、；插入片段可插入片段可多拷贝插入多拷贝插入。p当当DNADNA片段两端为片段两端为非同源的粘性末端非同源的粘性末端非同源的粘性末端非同源的粘性末端可实现定向克隆可实现定向克隆，连接效率高，简捷，连接效率高，简捷粘性末端连接粘性末端连接可可在在连连接接前前，用用碱碱性性磷磷酸酸酶酶将将载载体体DNA5端端 去去 磷磷 酸酸化化，这这样样只只有有载载体体和和插插入入片片段段之之间间才才能发生连接；能发生连接；11利利用用磷磷酸酸酶酶防防止止载载体体DNADNA的的重重新新环环化化12。质粒载体的定向克隆质粒载体的定向克隆13基因工程常用工具酶基因工程常用工具酶作作 用用限制性内切酶限制性内切酶识别
7、识别DNA特定序列，切割特定序列，切割DNA链链DNA聚合酶聚合酶I或大片段或大片段Klenowfragment1、切口平移制作标记、切口平移制作标记DNA探针；探针；2、合成、合成cDNA第二第二条链；条链；3、填补双链、填补双链DNA3凹端；凹端；4、DNA序列分析序列分析DNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNA分子或片断分子或片断TaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）逆转录酶逆转录酶合成合成cDNA第一条链第一条链T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化多核苷酸催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端标记探针羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶末端转移酶在在3末端加
8、入同质多聚物尾末端加入同质多聚物尾S1核酸酶、绿豆核酸核酸酶、绿豆核酸酶酶降解单链降解单链DNA或或RNA，使双链，使双链DNA突出段变为平端突出段变为平端DNA端酶端酶I降解降解DNA，在双链，在双链DNA上产生随机缺口上产生随机缺口RNA酶酶A降解除降解除RNA磷酸酶磷酸酶切除核酸末端磷酸基切除核酸末端磷酸基14E.coli.DNA聚合酶聚合酶IE.coli.DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段（Klenowfragment）T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶耐高温耐高温DNA聚合酶：聚合酶：TaqDNA聚合酶聚合酶DNAPolymeraseReverseTr
9、anscriptaseAlkalinephosphataseT4PolymeraseKinase细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶BAP牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶CIP修饰酶修饰酶修饰酶修饰酶15载载体体(vector)(vector)是是能能够够携携带带外外源源DNA进进入入宿宿主主细细胞胞进进行行扩扩增增和和表表达达的的DNA,它它们们一一般般是是通通过过改改造造质质粒粒、噬噬菌菌体体或或病病毒等构建而成的。毒等构建而成的。载载体体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒组组 合合 载载体体种种 类类 16p能在宿主细胞中独立复制能在宿主细胞中独立复制;p具具有有多多种种限限制制酶酶的的单单一一切切点
10、点（多多克克隆隆位点）以便外源位点）以便外源DNA插入；插入；p具具有有筛筛选选标标记记,以以区区别别阳阳性性与与阴阴性性重重组组分子分子;p分分子子较较小小，便便于于体体外外基基因因操操作作，同同时时载体载体DNA与宿主与宿主DNA便于分离；便于分离；p表表达达载载体体: :具具有有与与宿宿主主细细胞胞相相适适应应的的启启动动子子、增增强强子子、加加尾尾信信号号等等基基因因表表达达元元件。件。必要条件必要条件具备条件具备条件17分类分类 克隆载体：克隆载体：以繁殖以繁殖DNADNA为目的的载体，通常为目的的载体，通常分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。如分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。如
11、pBR322pBR322、pUCpUC、M13M13等。等。穿梭载体：穿梭载体：带有两种复制原点，在原核细胞带有两种复制原点，在原核细胞和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真核基因的克隆。核基因的克隆。表达载体：表达载体：以获得基因表达产物为目的的载以获得基因表达产物为目的的载体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数高和能在宿主细胞中高效表达等特点。高和能在宿主细胞中高效表达等特点。18克隆载体的特性克隆载体的特性 复制起始：在受体细胞中独立复制复制起始：在受体细胞中独立复制 多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切
12、点多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 多选择标记：抗药性，其他遗传标记多选择标记：抗药性，其他遗传标记 分子量小：能容纳的外源分子量小：能容纳的外源DNADNA片段尽可能大片段尽可能大 常用克隆载体常用克隆载体 质粒质粒 噬菌体噬菌体 Cosmid Cosmid Phagemid Phagemid 真核病毒真核病毒 YAC, BAC YAC, BAC19分类分类松弛型松弛型* *独立复制，拷贝数高独立复制，拷贝数高,10-200个个拷贝拷贝/细胞，例如细胞，例如pUC载体可达载体可达700个个/细胞细胞严紧型严紧型受受体染色体受受体染色体DNA复制控制，拷复制控制，拷贝数低，贝数低，1
13、-几个拷贝几个拷贝/细胞，例如细胞，例如pSC101天然型天然型人工型人工型* *可转移型可转移型不可转移型不可转移型* *氯氯霉霉素素扩扩增增氯氯霉霉素素可可抑抑制制染染色色体体DNADNA复复制制，但但质质粒粒复复制制不不受受影影响，可增加拷贝数。响，可增加拷贝数。1 1、什么是质粒、什么是质粒? ?2 2、质粒作为基因工程载体的原因、质粒作为基因工程载体的原因? ?3 3、质粒的分类、质粒的分类? ?基因工程使用的质粒的特点基因工程使用的质粒的特点? ?兼容型兼容型非兼容型非兼容型* *20克隆载体克隆载体pUC19pUC19质粒图谱质粒图谱克隆载体克隆载体pBR322pBR322质粒图谱质粒图谱21
