最新微生物检验技术PPT课件

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1、微生物检验技术微生物检验技术序论序论n了解食品中的微生物主要来源于土壤、空气和水，因此应注意食品从原料到加工、贮运、销售等各个环节的卫生。n了解不同微生物对营养的要求有不同，因此，不同食品的变质，引起其变质的微生物类群有不同。n了解评价食品质量的主要标准。n了解食品检验中细菌总数、大肠菌群数的定义及其检验意义。新鲜果蔬和果汁的腐败变质新鲜果蔬和果汁的腐败变质n开始引起新鲜水果变质的微生物是酵母菌和霉菌。引起蔬菜变质的主要是酵母菌、霉菌和少数细菌。起初霉菌在果蔬表皮，或其污染物上生长，然后霉菌侵入果蔬组织，首先分解细胞壁中的纤维素，进一步分解其中的果胶、蛋白质、有机酸、淀粉、糖类等，使其变成简单

2、物质。在外观上出现深色斑点，组织变松、变软、凹陷，渐成液浆状，并出现酸味、芳香味或酒味等。n果汁中主要发生乳酸菌以果汁中糖分、柠檬酸、苹果酸等有机酸为发酵基质的乳酸发酵和最常见的酵母菌引起的酒精发酵。在浓缩果汁中，一般性细菌难以忍受高浓度的糖分。果汁常见的霉菌是青霉，其次是曲霉。果汁变质后会呈现浑浊、产生酒精和有机酸变化，结果原有风味被破坏或产生一些不愉快的异味。乳及乳制品的腐败变质乳及乳制品的腐败变质n乳及乳制品的营养成分比较完全，都含有丰富的蛋白质、极易吸收的钙和完全的维生素等。因此极易为微生物所腐败变质。n鲜乳中污染微生物主要来源于乳房内的污染微生物和环境中的微生物。主要有乳酸细菌、胨化

3、细菌、脂肪分解细菌、酪酸细菌、产气细菌、产碱细菌、以及酵母和霉菌。它们在鲜乳中的生长有一定的顺序性，可以分为抑制期、乳酸链球菌期、乳酸杆菌期、真菌期和胨化细菌期， pH 值也是先下降再逐步回升。n含水量合格的奶粉不适宜微生物生长。但原料奶污染严重，加工又不当的奶粉中可能污染有沙门氏菌（ Salmonella ）和金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）等病原菌。这些病原菌可能产生毒素而易引起中毒。微生物引起淡炼乳变质，一是产生凝乳，即使炼乳凝固成块。由于作用的微生物不同，凝乳又可为甜性凝乳和酸凝乳；二是产气乳，即使炼乳产气，使罐膨胀爆裂；三是由一些分解酪蛋白的芽孢杆菌作

4、用，使炼乳产生苦味。n微生物引起甜炼乳变质也有三种结果：一是由于微生物分解甜炼乳中蔗糖产生大量气体而发生胀罐；二是许多微生物产生的凝乳酶使炼乳变稠；三是霉菌污染时会形成各种颜色的钮扣状干酪样凝块，使甜炼乳呈现金属味和干酪味等。肉、鱼、蛋类的腐败变质肉、鱼、蛋类的腐败变质n禽畜肉类的微生物污染，一是在宰杀过程中各个环节上的污染，二是病畜、病禽肉类所带有的各种病原菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、布鲁氏菌（ Brucella ）等。腐生性微生物污染肉类后，在高温高湿条件下很快使肉类腐败变质。肉类腐败变质，先是由于乳酸菌、酵母菌和其他一些革兰氏阴性细菌在肉类表面上的生长，形成菌苔而发粘。然后

5、分解蛋白质产生的 H 2 S 与血红蛋白形成硫化氢血红蛋白而变成暗绿色，也由于各种微生物生长而产生不同色素，霉菌生长形成各种霉斑。同时可产生各种异味，如哈喇味、酸味、泥土味和恶臭味等。n鱼类极易为水生微生物所引起腐败变质。假单胞菌、无色杆菌（ Achromobacter ）、黄杆菌（ Flavobacterium ）、产碱杆菌（ Alcaligenes ）、气单胞菌（ Aeromonas ）等，是新鲜鱼类的主要腐败菌。新鲜鱼类变质后组织疏松，无光泽，由于组织分解产生的吲哚、硫醇、氨、硫化氢、粪臭素等，而常有难闻恶臭。腌鱼由于嗜盐细菌的生长而有橙色出现。n鲜蛋也由于卵巢内污染、产蛋时污染和蛋壳污

6、染而发生微生物性腐败变质。污染鲜蛋的微生物有禽病病原菌、其他腐生性细菌和霉菌等。它们使鲜蛋成为散黄蛋，并进一步分解产生硫化氢、氨、粪臭素等，蛋液成灰绿色，恶臭或粘附于蛋壳、蛋膜上。罐藏食品的腐败变质罐藏食品的腐败变质n罐藏食品也会发生腐败变质，其原因在于杀菌不彻底，罐内仍残留有一定量的微生物，或者罐头密封不良而漏罐，外界进入微生物。n由于灭菌不彻底而残留的微生物，一般以嗜热性芽孢杆菌为主。它们所引起的罐头腐败变质有三种：一是罐头外观正常，但内部 pH 值可下降 0.10.3 ，称为平酸变质；二是 TA （ thermo-anaerobes ）嗜热性厌氧菌腐败，产气、产酸并可使罐头胀裂；三是产生

7、硫化物腐败食品。如罐头中未杀灭的是厌氧性梭状芽孢杆菌，则可能会进行丁酸发酵，并产生氢气和 CO 2 ，不产芽孢细菌的污染主要是由于罐头漏罐所引的，它们使罐头内食品发生浑浊、沉淀风味改变和产气胀罐。n 对于发生腐败变质的罐头食品，必须根据腐败变质的现象作微生物学分析，如是否产气胀罐，是否浑浊沉淀，是否变酸或 pH 上升等等，以便作出正确判断，避免腐败变质的进一步发生。食品微生物检验的任务和内容食品微生物检验的任务和内容n任务通过测定微生物指标，判断食品在加工环境和食品原料及其在加工过程中被微生物污染及生长的情况，为食品环境卫生管理和食品生产管理及某些传染病的防疫措施提供科学依据。食品微生物检验的

8、任务和内容食品微生物检验的任务和内容n检验的范围生产环境的检验原辅料的检验食品加工、储藏、销售环节的检验食品检验（重点）食品微生物检验的任务和内容食品微生物检验的任务和内容n食品微生物检验的指标n食品微生物检验的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。n菌落总数（个/1g、1cm、1cm2 )：清洁状态的标志；预测食品可能存放的期限. n大肠菌群(MPN/100ml):较为理想的粪便污染的指标菌群；作为肠道致病菌污染食品的指示菌.n致病菌(不得检出）：沙门氏菌、肉毒梭菌、志贺氏菌、

9、变形杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、霉菌 n霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青酶属的桔青酶、岛青酶等，镰刀酶属的串珠镰刀酶，禾谷镰刀酶等等。 n其它指标：微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标：如旋毛虫，囊尾蚴，住肉孢子虫、蛔虫，肺吸虫，弓形体，螨，姜片吸虫，中华分枝睾吸虫等等。食品微生物检验技术的发展现状及趋势食品微生物检验技术的发展现状及趋势n我

10、国食品卫生微生物检验质量控制工作现状分析我国食品卫生微生物检验质量控制工作现状分析；n食品微生物诊断新技术食品微生物诊断新技术食品微生物检验条件食品微生物检验条件学习目标：n了解微生物检验室的基本要求，通过学习，能独立建设一般的食品微生物检验室。n认识和熟悉微生物检验中常用仪器设备（尤其是普通光学显微镜）及其结构与性能，能正确使用和进行一般的维护。n认识和熟悉微生物检验中常用玻璃器皿，掌握灭菌消毒的技术要求。微生物检验室微生物检验室 微生物检验室要求高度清洁卫生，要尽可能地为其创造无菌条件。为达此目的，房屋的墙壁和地板，使用的各种家具都要符合便于清洗的要求。实验室管理制度实验室管理制度 1实验

11、室应制定仪器配备管理使用制度，药品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。2进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。3实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。4各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行菌种保管制度。5禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查

12、水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。6科、室负责人督促本制度严格执行，根据情况给于奖惩，出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。实验注意事项实验注意事项l每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验目的、原理和方法。初步熟悉实验操作的主要步骤和环节，对整个实验的安排做到先后有序、有条不紊和避免差错。l非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品（包括帽子、围巾等）应放在不影响实验操作的地方l每次实验前须用湿布擦净台面，必要时可用0.1“新洁尔灭”溶液擦。实验前要洗手，以减少染菌的概率。l微生物实验中最重要的一环，就是要

13、严格地进行无菌操作，防止杂菌污染。为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点：操作时要预防空气对流：在进行微生物实验操作时，要关闭门窗，以防空气对流。接种时不要走动和讲话：接种时尽量不要走动和讲话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅而导致杂菌污染。含菌器具要消毒后清洗：凡用过的带菌移液管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入5%石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染环境。含培养物的器皿要杀菌后清洗：在清洗带菌的培养皿、三角瓶或试管等之前，应先煮沸10min或进行加压蒸汽灭菌。要穿干净的白色工作服：微生物学工作者在进行实验操作时应穿上白色工作服，离开时脱去，并经常洗涤以保持清洁。l凡

14、须进行培养的材料，都应注明菌名、接种日期及操作者姓名（或组别），放在指定的温箱中进行培养，按时观察并如实地记录实验结果，按时交实验报告。l实验室内严禁吸烟，不准吃东西，切忌用舌舔标签、笔尖或手指等物，以免感染。l节约药品、器材和水、电、煤气。l各种仪器应按要求操作，用毕按原样放置妥当。l实验完毕，立即关闭煤气，整理和擦净台面，离开实验室之前要用肥皂洗手。值日生负责打扫实验室及进行安全检查(门窗、水、电及煤气等)实验注意事项实验注意事项l冷静处理意外事故：打碎玻璃器皿：如遇因打碎玻璃器皿而把菌液洒到桌面或地上时，应立即以5%石炭酸液或0.1%新洁尔灭溶液覆盖，30min后擦净。若遇皮肤破伤，可先

15、去除玻璃碎片，再用蒸馏水洗净后，涂上碘酒或红贡。菌液污染手部皮肤：先用70%乙醇棉花拭净，再用肥皂水洗净。如污染了致病菌，应将手浸于23来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液中，经1020min后洗净。菌液吸入口中：应立即吐出，并用大量自来水漱口多次，再根据该菌的致病程度作进一步处理：非致病菌：用0.1高锰酸钾溶液漱口。一般致病菌（葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌等）：用3H2O2、0.1高锰酸钾溶液或0.02米他芬液漱口。致病菌：如吸入白喉棒杆菌，在用法处理后，在注射1000U白喉抗毒素作紧急预防；若吸入伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌或霍乱弧菌等肠道致病菌，在经法处理后，可注射抗生素预防发病。衣服或易燃品

16、着火：应先断绝火源或电源，搬走易燃物品(乙醚、汽油等)，再用湿布掩盖灭火，或将身体靠墙或着地滚动灭火，必要时可用灭火器。皮肤烫伤：可用5鞣酸、2苦味酸（苦味酸氨苯甲酸丁酯油膏）或2龙胆紫液涂抹伤口。化学药品灼伤强酸、溴、氯、磷等酸性药剂：先用大量清水洗涤，再用5NaHCO3或5%NaOH中和。NaOH、金属钠（钾）、强碱性药剂：先用大量清水洗涤，再用5硼酸或5乙酸中和石炭酸：用95乙醇洗涤如遇眼睛灼伤：则应先用大量清水冲洗，再根据化学品的性质作分别处理，例如，遇碱灼烧可用5硼酸洗涤，遇酸灼烧可用5NaHCO3洗涤，在此基础上再滴入12滴橄榄油或液体石蜡加以润湿即可。检验室建设要求检验室建设要求

17、n选址与规模 （1）化验室应建设在远离粉尘、噪声、散发异味气体等地点，电源电压应当相对稳定的地点。根据企业规模和产品种类，应建设不同要求的化验室。但是，最小建筑面积：理化检验室不能小于30平方米；微生物检验室（无菌室）不能小于8平方米。这样有助于仪器设备的合理摆放，便于操作，便于样品流通和空气流通。（2）室内应有足够的照明条件。（3）室内必须配置干粉或二氧化碳灭火器，以备电器或化学品燃烧灭火使用。（4）所有电器插坐均应有牢固的地线装置，以防止设备带电，造成操作人员触电事故。有条件的还应在地面铺设绝缘胶板。其次还应必须有上下水设施、通风橱（在通风橱内进行对发生出有害气体的分析操作）。n室内的布局

18、(1)动仪器与静仪器分开：精密仪器（如光度计、天平、比色计、酸度计、色谱仪等）应必须与震动仪器（如震荡器、验粉筛、离心机、搅拌器等）。(2)常温与热源设备分开：热源仪器（如电热蒸馏水器、恒温干燥箱、高温电阻炉、恒温培养箱、水浴锅、电炉等）必须与其它一切设备分开，不然会影响其它设备的正常使用，严重的会造成热蒸汽腐蚀其它设备，影响其使用寿命。(3)化学分析台与热源设备分开：化学分析台面上应尽量少放易燃和腐蚀性试剂。使用电炉或酒精灯加热时应坚持有人看管和监视。化学分析台的摆放应远离热源设备。n化验室应建立可行的规章制度：化验室人员工作管理制度、标准管理制度、危险化学试剂的管理制度 、检验过程的管理制

19、度 检测设备检定管理制度 检验室建设布局图检验室建设布局图 1.办公台 2.文件柜 3.样品柜 4.通风橱 5.实验边台 6，7.无菌台 8.天平台9.在落地仪器区再加个高温仪器台，放高压灭菌锅、干燥箱、水浴锅、电热板等微生物实验室主要设备和器具微生物实验室主要设备和器具n无菌室（接种室）或接种箱 n恒温箱n电烘箱（干燥箱）n冰箱n高压蒸汽灭菌锅n离心机n接种针n天平n酒精灯n显微镜n常用玻璃器皿n均质器、试管夹，吸管，移液枪，脱脂棉，牛皮纸，棉绳，纱布，剪刀无菌室建设无菌室建设 新建无菌室的处理程序新建无菌室的处理程序 n先用3%的煤酚皂擦洗工作台面及地面，再用甲醛加高锰酸钾熏蒸空气。日后要

20、定期熏蒸；n每两星期用酒精棉球擦拭紫外线灯管；n每次使用无菌室前用紫外灯照射3060分钟；n每次使用完无菌室后，要及时用3%的煤酚皂擦洗工作台面及地面。超净工作台的使用超净工作台的使用n使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。n接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，30分钟后，关闭紫外灯，开启送风机 n工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰n操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。n最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。 n

21、每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。 n每月进行一次维护检查，并填写维护记录 。n每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。n取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘、用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干；要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁,否则会影响杀菌能力；设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。 微生物检测作业规范微生物检测作业规范l各培养液配制完成后，杀菌前放入冰箱冷藏保存，但必须在48小时内对其进行分装杀菌使用。l已杀菌未开封的培养液在

22、24小时内可直接使用；已杀菌未开封超过24小时或者已杀菌但开封而未用完的培养液都必须重新杀菌后使用。同一培养液反复杀菌不超过2次。杀菌时间由当班微检员用油笔直接写在瓶体。l杀菌锅密闭前，内桶顶部覆盖一层报纸。l进入无菌间作业时必须做到：缓冲间、无菌间的紫外灯开启时间超过半小时；关闭紫外灯后，微检员把作业过程中将用到的所有物品放在缓冲间，同时在缓冲间更换专用的工作衣，同时佩戴口罩和卫生帽，然后再将物品转移到无菌间；作业时关闭紫外灯、空调、和无菌操作台风机；每次最多做4个样品。每次均做空白对比（除非有特殊说明）。l完成作业后，立即做好相关标识、填写微生物检验培养登记表，然后清理无菌间。清理结束后，

23、开启紫外灯杀菌30分钟。l无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅；无菌操作台上最多只允许摆放以下物品：物物 品品数数 量量物物 品品数数 量量酒精灯1个灭菌营养琼脂200ml打火机1个灭菌双料发酵管6根接种针1个灭菌单料发酵管12根消毒面团1瓶灭菌平皿10块洗耳球1个试管架2副镊子1个2ml灭菌吸管5根油笔1支10ml灭菌吸管3根试管篓2个125ml灭菌烧杯2个微生物检测作业规范微生物检测作业规范l微生物培养24小时后，当班微检员仔细观察、如实填写培养的现象，任何异常情况都必须及时报告；晚班的微检员可将有异常情况的培养液交接给白班，并保证其免受污染。l口罩、卫生帽每人次使用两天，无菌间缝单日

24、定期拖地、专用的工作衣每周定期清洗，具体人员由班长另行安排。细菌形态学检验技术细菌形态学检验技术细菌形态学检验内容：菌体形态、大小、排列、特殊结构细菌形态学检查方法：不染色细菌标本检查法和染色细菌标本检查法不染色细菌标本检查法不染色细菌标本检查法不染色的细菌标本的镜检可直接观察到细菌活体的形态、大小、运动（了解菌是否有鞭毛）悬滴法和压滴法不染色细菌标本检查法不染色细菌标本检查法 悬滴法悬滴法n制备菌液制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌于盛有12ml无菌水的试管中，制成轻度浑浊的菌悬液。n涂凡士林涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。n滴加菌液：滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的

25、中央，并用削尖的记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。n盖凹玻片：盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘合在一起，然后翻转凹玻片，菌液正好悬在凹槽的中央，再用火柴棒轻压盖玻片使四周边缘闭合，以防菌液干燥。n镜检：镜检：先用低倍镜找到标记，再稍移凹玻片即可找到菌悬滴的边缘，然后将菌液移到视野中央。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动）不染色细菌标本检查法不染色细菌标本检查法 压滴法（水封片法）压滴法（水封片法）n制水封片：加1滴菌液于洁净无

26、油的载玻片中央，然后取1滴洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，再慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。若镜检好氧菌时，应在水封片中留12个小气泡，然后再观察气泡四周细菌的运动能力，否则因盖玻片内供氧不足而抑制了细菌的运动。n镜检：先用低倍镜观察，然后再转至高倍镜或油镜下观察，观察的要求同悬滴法。不染色细菌标本检查法不染色细菌标本检查法 注意事项n结果记录结果记录n注意事项注意事项检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动制水封片时，菌液不可加得太多，因过多的菌液会盖玻片下流动，从而影响了对细菌正常运动的观察。菌名悬滴法或水封片法细菌的运动方式判断有、无鞭毛普通变形杆菌铜绿假单

27、胞菌黄色金葡萄球菌染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 染料染料细菌染色用的染料细菌染色用的染料酸性染料酸性染料（阴离子染料）：染色离子带阴电荷，能与带阳电的物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸性染料染色。（伊红、刚果红）碱性染料碱性染料（阳离子染料）：与带负电的物质结合，细菌一般带负电，细菌一般带负电，所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料（碱性复红、美蓝）。复合染料复合染料：碱性染料与酸性染料的结合物（伊红美蓝、伊红天青）。单纯染料：单纯染料：不能与被染物生成盐类影响染色的因素影响染色的因素细菌的结构：细胞壁的结构、细胞膜的通透性、膜孔的大小培养基：组成、菌龄、pH染

28、色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 制片方法制片方法制片：制片：（制片是染色的关键，如不注意菌体涂布的均匀度，会造成染料的大面积堆积，而使观察结果不理想）制片：制片：在干净的载波片（平时放在95%酒精中)上滴一滴蒸馏水或无菌水，用接种工具进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中与水混合做成悬液，并涂成直径约1cm的薄层。若材料为液体培养物或自固体培养物中洗下制备的菌液，则可直接涂布于载玻片上。涂布要均匀，菌体间少重叠。干燥：干燥：涂布最好在室温下使其干燥，有时为之使之干燥得快些，小心地在酒精灯火焰高处微微加热。固定固定：标本干燥后即进行固定，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快地来回通过34次

29、，共23s，并不时以载玻片的加热面触及皮肤，其目的：杀死微生物，固定细胞结构；保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，防止标本被水洗掉；改变染料对细胞的通透性，因为死细胞的原生质比活细胞的原生质易于染色。注意事项：注意事项：载玻片要洁净无油，否则菌液涂不开，且固定效果不好，水洗时易被水冲掉。为避免因菌数过多聚成团而不利于观察个体形态，可在载玻片一端加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于水滴中进行稀释，涂布成薄层。干燥时，切勿靠火焰太近或加热时间过长，以防标本烤枯而使菌体变形。染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 染色分类单染色法单染色法：用一种染色剂对涂片进行染色。该法简便易行，但仅能显示细胞的外部形态

30、，而不能辨别其内部结构，适用于微生物的形态观察。复染色法复染色法：主要的复杂染色法有革兰氏法和抗酸性及特殊染色法。因为细菌除了具有细胞壁、细胞膜、原生质和核等基本构造外,某些细菌还具有荚膜、芽孢、鞭毛和异染颗粒等特殊结构，这些结构不能被一般染色方法着色，必须用特殊的方法才能着色。负染色法负染色法：负染色法是一种特殊的染色方法，是指背景着色而细菌本身不着色。一般使用酸性染料，如刚果红或水溶性苯胺黑。固定染色涂片可浸于酸性酒精中，因刚果红经酸性酒精处理后，涂片的背景便从红色（盐类的颜色）转变为蓝色（即刚果红游离的颜色），这样可使对比性更为鲜明。 负染色法除用于观察细胞形态外，还可区别死菌与活菌，因

31、死菌可被酸性染料着色，部分自溶的细菌也能轻度染上酸性染料，而活菌却不着色。染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 简单染色方法简单染色方法菌名染色液名称菌体颜色菌体形态（图示）大肠埃希氏菌金黄色葡萄球菌染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 革兰氏染色法革兰氏染色法阳性菌阳性菌阴性菌阴性菌染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 革兰氏染色法革兰氏染色法注意事项：注意事项：单一菌落染色后看到红色杆菌和紫色杆菌共存的情况，特别明显既有红色的，也有紫色的？（脱色时间脱色时间：受涂片之厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。菌龄菌龄：选用培养1824h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，

32、由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应）显微镜观察：紫和红好象都是，焦距调的稍近时紫色，调的稍远时红色，两种情况下形状都看的挺清楚，杆状。关于颜色你们怎么确定的？ （对照：当确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合混合图片图片）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。用洗衣粉水煮沸、清洗、沥干备用。结果记录：结果记录：菌种菌体颜色菌体形态G+或G-大肠埃希氏菌金黄色葡萄球菌细菌未知种染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 芽孢染色法芽孢染色法原理：原理：细菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的透

33、性差，不易着色，但是一旦着色又难以脱色。芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热条件下进行。染色完毕，用自来水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水洗掉，而进入芽孢中的孔雀绿却难以溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染使菌体和芽孢呈现不同的颜色。方法与步骤方法与步骤制片：将培养24小时的细菌涂片、干燥、固定染色：将孔雀绿染色液滴加35滴于标本上。用试管夹夹住载玻片在火焰上加热约5min（当染料冒蒸汽时开始计时）。在加热过程中要随时加染色液，切勿煮沸或使样本干涸。水洗：待载玻片冷却后，用自来水冲洗复染：用番茄红染色液染色1min。水洗、干燥，置于油镜下观察并绘图说明。结果结果染色

34、细菌标本检查法染色细菌标本检查法 芽孢染色法芽孢染色法改良方法：改良方法：制备菌液：加12滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取23环的菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。加染色液：加5孔雀绿染色液23滴于小试管中，用接种环搅拌使染色液与菌液充分混合。加热：将此试管浸于沸水浴中，加热1520min。涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的玻片上，并涂成薄膜。固定：将玻片通过微火3次。脱色：用水洗，直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。复染：加沙黄染色液，染23min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水吸干。镜检：用油镜观察结果纪录结果纪录菌名染色法芽孢和菌体的颜色图示芽孢的形态、大小和着生位

35、置染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 芽孢染色法芽孢染色法注意事项：供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体内。 巨大芽孢杆菌在37条件下培养1214h效果最佳。改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规法优越，可优先使用。用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次从小试管中挑取被染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 鞭毛染色法鞭毛染色法鞭毛染色方法基本原理雷同，即在染料前先经媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。银染色法：银染色法：清洗玻片：清

36、洗玻片：将玻片插在专用金属架上，再放入洗衣粉过滤液（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒）中，煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗，晾干。再放浓洗液中浸泡56d。使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95乙醇中脱水。过火去乙醇，立即使用。配制染色液配制染色液：A A液：液：鞣酸（丹宁酸）5g，FeCl3 1.5g，蒸馏水100ml。待溶解后，加1NaOH溶液1ml和15甲醛溶液2ml；B B液：液：硝酸银2g溶于蒸馏水100ml中。 在90mlB液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mlB液小心滴加至澄清液中，至出现轻雾状为止（此操

37、作非常关键，应格外小心）。在整个滴加过程中要边滴边加充分摇荡。配好的染色液当日有效，4h内效果最好。涂片涂片：用接种环挑取数环菌液于玻片的一端，立即将玻片倾斜，让菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片在空气中自然干燥。染色：滴加A液（46min) 用蒸馏水充分洗净A液 用B液冲去残水，在用B液于涂片上，用微火加热至冒烟，维持0.51min（加热时应随时补充蒸发掉的染色，不可使玻片出现干涸区 用蒸馏水洗，自然干燥。镜检：用油镜观察，并记录结果。 染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 鞭毛染色法鞭毛染色法LeifsonLeifson氏染色法：氏染色法：清洗玻片清洗玻片：同银染法配制染色

38、液：配制染色液：A A液液：碱性复红1.2g，95乙醇100ml；B B液液：鞣酸3g，蒸馏水100ml（如加0.2苯酚，可长期保存）；c c液：液：NaCl 1.5g，蒸馏水100ml。 染色液分别贮藏于磨口玻璃瓶中，在室温下较稳定。使用前将上述溶液等体积混合，将混合液贮藏于封密性良好的瓶中，置冰箱中可保存数星期。在较高温度下因混合液发生化学变化而使着色力日益减弱。菌液的制备及涂片菌液的制备及涂片：菌液的制备同银染法用记号笔在玻片的反面划分34个相等的区域放1环菌液于每个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一边，并用滤纸吸去多余的菌液在空气中自然干燥。染色染色：加染色液于第一区，使染料覆盖涂

39、片区。数隔分钟后染料加入第二区，以后以此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，且节约材料。在染色过程中要仔细观察，当整个玻片出现铁锈色沉淀和染料表面出现金色膜时，即用水轻轻地冲洗，一般约染10min。 在没有倾去染料的情况下，就用自来水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀自然干燥。镜检镜检染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 鞭毛染色法鞭毛染色法注意事项：注意事项：银染色法比较容易掌握，但染色液必须每次配制，比较麻烦。Leifson氏染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。其优点是染色液可保存较长时间。细菌鞭毛极细，很容易脱落，在整个操作过程

40、中，必须仔细小心。菌龄较老的细菌鞭毛易脱落，所以在染色前应将变形杆菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接几代，以增强细菌的活动力。最后一代菌种放37恒温箱中培养1518h。然后用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有12ml无菌水的试管中，使菌液呈轻度浑浊。将该试管放37恒温中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 荚膜染色法荚膜染色法荚膜是细菌在新陈代谢过程中形成的分泌于细胞壁外的黏液状物质。其主要化学成分是多糖、多糖类物质。荚膜的折光率低，与染料的亲和力差，不易着色

41、。通常采用负染色方法：使菌体和背景着色而荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90以上，故染色时一般不用热固定或微热固定，以免荚膜皱缩变形。染色细菌标本检查法染色细菌标本检查法 荚膜染色法荚膜染色法制片制片：在载玻片一端加一滴6葡萄糖液，取少许培养72h的被检样菌与其充分混合，再滴一滴新配制的黑色素溶液（或墨汁），混匀。左手持载玻片，右手拿另一光滑的载玻片（推片），将推片一端边缘置于菌液前方，然后稍后后拉，当接触菌液后，轻轻地左右移动，使菌液沿推片接触后缘散开，以30。 角迅速而均匀地将菌液推向玻片另一端，将菌液涂成一薄膜，风干。染色：染色：加番茄红染色液于标本上，30s后，用细水流适当

42、冲洗。干燥、镜检：干燥、镜检：背景成黑色，菌体呈红色，荚膜无色结果与讨论结果与讨论按上述方法，在番茄红之前，用甲醇固定1min亦可；按上述方法，用石炭酸复红液代替蕃红液，染色2min，结果同上。Tyler法：主要采用结晶紫冰醋酸染色液染色57min。然后用20CuSO4 水溶液洗涤，干燥后镜检。结果荚膜呈蓝紫色，细胞暗蓝色。培养基制备技术培养基制备技术 -玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。 1、新购的玻璃

43、器皿 除去包装沾染的污垢后，先用热肥皂水刷洗，流水冲净，再浸泡于的工业盐酸中数小时，使游离的碱性物质除去，再以流水冲净。对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上将水空干，即可使用。 2、用过的玻璃器皿 凡确无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用后可随时冲洗，吸取过化学试剂的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。有可能被病原菌污染的器皿，必须经过适当消毒后，将污垢除去，用皂液洗刷，再用流水冲洗干净。若用皂液未能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。洗液的主要成份是重铬酸钾和浓流

44、酸，其作用是将有机物氧化成可溶性物质，以便冲洗。洗液有很强的腐蚀作用，使用时应特别小心，避免溅到衣服、身体和其他物品上。培养基制备技术培养基制备技术 -培养基分类培养基分类n根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分：根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分： ）天然培养基 天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤

45、其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。 ）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。 ）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。n根据培养基的物理状态来区分：根据培养基的物理状态来区分： ）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分

46、基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。 ）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。 ）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.21%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。培养基制备技术培养基制备技术 培养基的分类培养基的分类根据培养基的用途来区分： (1) (1)通用培养基通用培养基：培养异氧细菌最常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基；配制适合于厌氧菌生长的培

47、养基时，通常须在培养基中加入适量的还原剂如巯基醋酸钠、维生素C或半胱氨酸来降低培养基的氧化还原电位，以利于厌氧菌的生长。 (2) (2)鉴别培养基鉴别培养基：是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌落的培养基。(伊红美蓝琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、亚硫酸铋琼脂、微生物快速显色培养基） (3) (3)选择性培养基选择性培养基：根据某微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌。（马丁氏培养基、Ashby无氮培养基）n有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中

48、常用的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。培养基制备技术培养基制备技术 培养基制备的基本方法和注意事项培养基制备的基本方法和注意事项 n培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长;n因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。n培养基的分装，应按使用的目的和

49、要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内:液体分装至试管1/4左右 为宜；如固体则分装量为管高的1/5；半固体培养基，则分装至试管的1/21/3为宜；锥形瓶分装培养基时，容量应不超过容积的一半为宜；9cm的培养皿可倒入15ml培养基。n一般培养基可采用121C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50C左右的培养基中。 灭菌和消毒 n消毒是指应用消毒剂等方法

50、杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法， n灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。 灭菌和消毒 物理方法物理方法 n温度 ：利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。a.灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。b.干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿

51、、金属用具等的灭菌。附：电热恒温干燥箱（俗称附：电热恒温干燥箱（俗称“烤箱烤箱”）的使用）的使用 把待灭菌的物品均匀地放入烤箱中，关上箱门，调节温度至160C，打开电源，待温度上升至160C时计时，维持该温度0.5-1小时。注意：多观察几次温度，防止温度失控。用量较少的实验室可以做几个铁皮筒，盖子侧面带孔，灭菌时将孔打开，灭菌冷却过后将孔关闭。可以将吸管每支单独用白纸包裹用脱水粘上（防止纸散开来），装入铁皮筒灭菌，使用时可以单独拿，避免污染其它吸管。玻璃皿也可以单独用白纸包裹用脱水粘上，装入铁皮筒灭菌。无菌瓶可以盖上盖子，用用白纸包起盖子，用棉线扎起来，不可以用尼龙线，因为尼龙线不耐高温，易断

52、。灭菌和消毒 物理方法物理方法n湿热灭菌法:在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。a.巴氏消毒法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62C，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。b.煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸钠或

53、2%的石炭酸，则效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.间歇灭菌法：上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将待灭菌的物品加热至100C，1530分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37C恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。灭菌和消毒 物理方法物理方法d. 加压蒸汽灭菌法：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。

54、在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121C。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在1520分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。 在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。附：高压锅的使用附：高压锅的使用打开锅盖，取出内锅，观察水量，补充水量至比墩子略高，将需灭菌的物品放入内锅，盖上盖子，对称旋紧螺栓，关闭放气阀，打开电源，待压力表上指针指向0.05时打开放气阀放冷气，等到压力表上指针指

55、向0时关闭放气阀，待压力表上指针指向0.05时再次打开放气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀；冷气放完后，待压力表上指针指向0.10时打开放气阀，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，反复放气2-3次，最后拨下电源，不打开放气阀，让其自然冷却。取物品时一定要将放气阀打开，等到压力表上指针指向0时方可对称旋松螺栓，打开盖子取出物品。 灭菌和消毒 物理方法物理方法n影响灭菌的因素影响灭菌的因素 a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒在5065C，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121C，

56、12分钟才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感; b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长; c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。n灭菌对培养基成分的影响灭菌对培养基成分的影响 a.pH值普遍下降; b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀; c.不少培养基颜色加深; d.体积和浓度有所变化; e.营养成分

57、有时受到破坏。灭菌和消毒 物理方法物理方法n辐射：利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面：）接种室、手术室、食品、药物包装室常应用紫外线杀菌。）应用射线作食品表面杀菌，射线用于食品内部杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延长。n过滤：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分

58、。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。灭菌和消毒 化学方法化学方法n一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。n能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂。能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物，称为防腐剂。但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。消毒剂在低浓度时也能杀菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐剂没有选择性，因此对一切活细胞都有毒性，不仅能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械、排泄物和周围环境的消毒。常用的化学消毒剂有：石碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化

59、汞、碘酒、酒精等。 微生物的分离、纯化与接种技术微生物的分离、纯化与接种技术接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。接种和分离工具 1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 微生物的分离、纯化与接种技术微生物的分离、纯化与接种技术划线接种： 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环

60、，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。划线接种，分离纯化Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies灼烧灼烧微生物的分离、纯化与接种技术微生物的分离、纯化与接种技术斜面接种技术微生物的分离、纯化与接种技术微生物的分离、纯化与接种技术 细菌的涂布分离技术微生物的分离、纯化与接种技术微生物的分离、纯化与接种技术 液体接种法、穿刺接种穿刺接种液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要求无菌操作。微生物的培养微生物的培养 微生物培养中的氧气条

61、件n培养设备：培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵摇摇床、厌氧培养罐等。床、厌氧培养罐等。n好氧培养：好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。n厌氧培养：厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条件。对于

62、严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。在进行厌件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用的如葡萄糖的如葡萄糖美兰指示剂。美兰指示剂。微生物的培养微生物的培养 微生物培养中的厌氧条件n生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。n化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用吸水紙包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密

63、封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。n物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。微生物的培养微生物的培养 微生物培养中的厌氧培养n美兰氧化还原指示剂：0.006N NaOH 0.015% 美兰溶液 6 葡萄糖溶液 上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅速放入厌氧罐中。 微生物细胞大小和数量的测定n目的要求：学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法；学习使用血

64、球记数板测定微生物测定微生物大小的方法；学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。数量的方法。n实验材料：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、细菌染色显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、细菌染色片、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、西水片、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、西水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯测定微生物的大小测定微生物的大小n测定的工具：目镜测微尺测定的工具：目镜测微尺 镜台测微尺镜台测微尺测定微生物的大小测定微生物的大小n 目镜测微尺的校正：在高倍镜下，看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺的0

65、点与镜台测微尺的某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计算两刻度间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻度每格长10m，所以可得： 目镜测微尺每格长度（目镜测微尺每格长度（mm）= =（镜台测微尺格数镜台测微尺格数1010）/ /目镜测微尺格数目镜测微尺格数 注意：校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜、接目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这特定的情况下才可重复使用。n菌体大小的测定：取下镜台测微尺，将细菌染色标本置于载物台上，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的长和宽。测定微生物数量测定微生物数量n方法：活菌计数法方法：活菌计数法平板菌落计数法；

66、总菌计数法平板菌落计数法；总菌计数法血球计数板或霍瑟血球计数板或霍瑟（Peroff HausserPeroff Hausser）细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。 测定微生物数量测定微生物数量n本实验用血球计数板计数酵母菌的数量 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。 高倍镜下计数：随机计数五个中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总菌数，最后再换

67、算到每mL菌液中的含菌数。计算方法：注意事项：压在方格线上的菌体，以压在底线和右侧线上的菌体计入本格内；遇到有芽体的酵母时，若芽体和母体同等大，就按单个酵母计数。计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。（X1+X2+X3+X4+X5）5 25（或（或16）10 1000 稀释倍数稀释倍数 酵母菌细胞数酵母菌细胞数/mL=细菌生理学检查法 微生物保藏方法n斜面冰箱保藏法：斜面冰箱保藏法：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，

68、放入40C冰箱中保藏。一般每隔3个月至半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验室均采用。 缺点：移接代数太多，易产生变异、退化缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。n石蜡封藏法：石蜡封藏法：在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线菌。 石蜡的处理：250mL三角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3高压灭菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸发掉。n砂土管保藏法：砂土管保藏法：(可用于保藏产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的细菌）。 1.砂土管的制备：取河沙若干，用40目过筛，出去大颗粒，加10HCl后煮沸30min，除

69、去有机质（也可用10HCl浸泡24h)。最后倒去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取0.3m以下非耕作层的瘦黄土若干，晒干磨细，过120目筛。 2.按 土：砂1：4 的比例均匀混合，装入指形管中，以1cm高为宜，塞上棉塞，1601700C干热灭菌2h。 3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右的无菌水，用无菌接种环制成菌悬液，用无菌吸管吸取0.20.3mL的菌悬液放入每个砂土管中，用接种环拌匀，并贴上标签，注明菌名。 4.菌液加好后，立即进行抽真空干燥，要求在24h内抽干，尤其是夏天要求较短时间内抽干。摇散砂土，放干燥器内冰箱保藏。 冷冻真空干燥保藏法：冷冻真空干燥保藏法：此法一般常用于细菌或病

70、毒一类的菌种保藏，常用脱脂牛奶或血清作为菌种的保护剂。细菌生理学检查法 微生物生化反应生化反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。 糖酵解试验 淀粉水解试验 V-P试验甲基红（Methyl Red）试验靛基质（Imdole）试验枸椽酸盐试验：尿素酶（Urease）试验三糖铁（TSI）琼脂试验细菌生理学检查法 糖酵解试验糖酵解试验 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。 细菌生理学检查法 淀粉水解试验淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，

71、遇碘不再变蓝色。 细菌生理学检查法 乙酰甲基甲醇（V-P）试验试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。细菌生理学检查法 甲基红（甲基红（MR）试验试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。细菌生理学检查法 靛基质（靛基质（吲哚吲哚）试验）试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚

72、的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。细菌生理学检查法 柠檬酸盐试验柠檬酸盐试验某些细菌能利用柠檬酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。细菌生理学检查法 尿素酶（尿素酶（Urease）试验试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。1、未接种2、尿素酶阳性3、尿素酶阴性细菌生理学检查法 三糖铁（三糖铁（TSI）琼脂试验琼脂试验本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但

73、因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。 a.uninoculatedb.littlechange/alkaline/-/-c.alkaline/acid/-/+d.acid/acid/+/+e.acid/acid/+/-细菌生理学检查法 沙门氏菌的沙门氏菌的TSI试验试验食品卫生细菌学一般检验技术学习目标：n熟悉微生物检验的基本程序和要求；n掌握食品微生物检验中常见检样的制备技术；n熟悉食品微生物检验中细菌总数、大肠菌群数的检验程序；n熟悉掌握食品微生物检验中细菌总数、大肠菌

74、群数检测的操作技术，并能获得正确的检验结果，写出规范的检验报告。食品卫生细菌学一般检验技术 食品卫生细菌学检验的目的，是要对食品进行细菌卫生评价。这就要求检验人员在求实的精神下，科学地进行被检对象的采样、样品送检、检样处理、检验以及报告。在整个过程中，不得掺杂检验人员的丝毫主观臆想和工作上的马虎，要有章可依地进行检验和报告。 样品的采样送检样品的处理检验与报告 食品微生物检样的采集n样品种类样品可分大样、中样、小样三种。大样是指一整批样品；中样是指从样品各部分取得的混合样品，定型包装及散装食品均采样及散装食品均采样250g；小样系指分析用的样品，又称为检样，检样一般为25g。n采样的方法根据样

75、品，如袋装、瓶装或罐装食品，应采用完整的未开封的样品；检样是冷冻食品，应保持冷冻状态（可放在冰内、冰箱的冰盒内或低温冰箱保存），非冷冻食品需在05中保存。（1）液体样品的采样：将样品充分混匀，无菌操作开启包装，用100ml无菌注射器抽取，放入无菌容器。（2）半固体样品的采样：无菌操作开启包装，用灭菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。（3）固体样品的采样：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位取样，应兼顾表面和深度，注意样品代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。样品是固体粉末，应边取样边混合。食品微生物检样的采集（4）冷冻食品的采样：大包装小块冷冻食品的采样按小

76、块个体采取；大块冷冻 食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冷冻上锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎样品，放入无菌容器。注：固体样品或冷冻食品取样还应注意检样目的，若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应再取深部样品。（5）生产工序监测采样车间用水：自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部位用100ml无菌注射器抽取。车间台面、用具及加工人员手的卫生监测：用板孔5cm2无菌采样板及5支无菌擦拭25cm2面积。车间空气采样：将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖上平板送检。食品微生物检样的采集采样的数量

77、采样的标签：采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚，如品名、来源、数量、采样地点、采样人及采样时间（年、月、日）取样注意事项：防止交叉污染或二次污染：取样人员的个人卫生控制 ；取样地点的环境控制，空气净化要达到要求；取样的器皿要求彻底消毒，避免直接与空气接触 ；取样的操作要规范、迅速（无菌操作） ；减少样品存放的时间（保持样本原有的状态、易变质的样本要冷藏）取样要有代表性：取样的数量标准；取样的方法采样所出的问题 食品微生物检验的样品送检食品微生物检验的样品送检 采样后，在送检过程中，要尽可能保持检样原有的物理和微生物状态，不要因送检过程而引起微生物的减少或增多。l无菌方法采样后，所装

78、样品的容器要无菌，装样后尽可能密封，以防止环境中的微生物进一步污染；l进行微生物检验的样品，送达实验室要越快越好，一般不应超过3h。若路途遥远，可将不需冷冻的样品，保持在15 环境中送检，可采用冰桶等装置；若需保持在冷冻状态（如已冰冻的样品），则需将样品保存在泡沫塑料隔热箱内，箱内可置干冰，使温度维持在0以下，或采用其他冷藏设备；l送检样品不得加入任何防腐剂；l水产品因含水分较多，体内酶的活力较旺盛，易于变质。因此，采样后应在3h内送检，在送检途中一般都应加冰保存；l对于某些易死亡病原菌检验的样品，在运送过程中可采用运送培养基。l检样标注适当的标记并填写微生物学检验特殊要求的送检申请单。其内容

79、包括：样品的描述，采样者的姓名，采样的日期、时间、地点，采样时的温度和湿度等食品微生物检验的样品处理食品微生物检验的样品处理不同食品的处理方法样品处理的问题食品微生物检验的检验与报告食品微生物检验的检验与报告n检验：检验样品送到实验室后，立即将样品置于普通冰箱或低温冰箱中，并进行登记、填写实验序号，按检样检样要求，积极准备条件进行检验。样品收集后应于36h内检验；n报告：按样品项目完成各类检验后，检验人员应及时填写检验报告单，签名后送主管人员签字，加盖单位印章，以示生效，立即交食品卫生监督人员处理； 实验室必须具有专用冰箱存放样品，对于一般阳性样品，在发出报告3天（特殊情况可适当延长）方可处理

80、样品；进口食品的阳性样品，需保存6个月，才可处理；而对于阴性样品可及时处理。食品卫生微生物检验中常见检样的制备n肉与肉制品检样的制备n乳与乳制品检样的制备n蛋与蛋制品检样的制备n水产品检样的制备n饮料、冷冻饮品检样的制备n调味料检样的制备n糖果、糕点和蜜饯检样的制备n酒类检样的制备n方便面（速食米粉）检样的制备n罐藏食品检样的制备菌落总数的测定 测定方法n标准平板培养计数法（活菌计数法）n显微镜直接计数法n菌落总数快速检测纸片 n电阻抗法测定食品中细菌总数菌落总数的测定菌落总数的测定 平板菌落计数法平板菌落计数法 程序程序菌落计数选择23个适当稀释度悬液各1ml，加入无菌空培养皿内，每个稀释度

81、做23个培养皿用生理盐水进行无菌稀释，做成几个适当稀释倍数的悬液每个培养皿中倾注约1.5ml熔化并冷却到45 左右的营养琼脂或肉汤琼脂培养基，冷却后，于37培养24h 被检样品报告结果 菌落总数的测定菌落总数的测定 平板菌落计数法平板菌落计数法 操作要点操作要点n将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基置于45 恒温水浴锅中保温备用。n编号:无菌试管（10-1 、10-2 、10-3 、10-4。）、无菌培养皿、空白对照平板n稀释菌液：n摇匀平板：平板前后、左右或者以顺时针、逆时针。n倒置培养菌落总数的测定菌落总数的测定 平板菌落计数法平板菌落计数法 菌落计数报告菌落计数报告例次不同稀释度的平均菌落数菌落总平

82、均数及报告方式（个/ml，或个/g）10-110-210-3两个稀释度菌落数之比114681742017400或1.7 1042多不可计29546460/2951.637750或3.8 1043多不可计27160600/2712.227100或2.7 1044多不可计1550511511000或5.1 105528107280或2.8 1026000 1 10或 107多不可计3031830300或或3.0 104菌落总数的测定菌落总数的测定 平板菌落计数法平板菌落计数法 菌落总数记录报告菌落总数记录报告产品名称生产车间班次生产日期抽样日期检验日期细菌总数检验依据 培养基接种营养琼脂培养基结果

83、报告数（个/g或ml）AB平均数110-110-210-310-410-5空白备注检验员：日期：复核：日期：菌落总数的测定菌落总数的测定 平板菌落计数法平板菌落计数法 注意事项注意事项检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质残留有抑菌物质 。充气饮料应在无菌条件下进行排气；酸性样品用经过灭菌的2030碳酸钠溶液调整pH值至中性；高盐样品应用灭菌蒸馏水进行稀释。在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸贴于玻璃瓶或试管

84、的内壁使吸；当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。 计数表示方法：CFU /ml或个（国际标准）菌落总数的测定菌落总数的测定 其他菌落总数的测定其他菌落总数的测定平板菌落计数法测定的是在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧或兼性厌氧的菌落总数。厌氧菌、嗜冷菌、嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制。嗜冷菌计数（新鲜鱼贝）操作要点操作要点：采样后尽快冷藏检验；稀释液涂布于T

85、S或CVT琼脂平板上，平板倒置于冰箱中冷藏培养。嗜热菌操作要点操作要点：采样煮沸5min（杀死细菌繁殖体）；厌氧菌操作要点操作要点：稀释液与45硫乙醇酸钠琼脂混合摇匀，倒平板，在其上封一层3无菌琼脂。菌落总数的测定菌落总数的测定 出现的实际工作问题出现的实际工作问题做菌落总数检测时,发现稀释倍数大的比稀释倍数小的平皿上生长的菌落数还多,而且空白对照又没长菌,我找不出啥原因？我做的菌落总数的测定，是把浓缩的复合芽孢杆菌进行10-8、10-9、10-10稀释，在涂布法吸取0.1ml的3个浓度的时候，培养皿中长出来的菌2个10-9长了一大片的菌连在一起，10-8也有一个这样，其他的几乎不长，究竟怎么

86、会事？检测菌落总数时,有些菌落难以区别,有没有什么好的试剂,能增加菌落的可见率？我公司做的菌落总数和技术监督局所测的数目存在巨大差别.是这样的:我公司跟客户采购一批的鸡粉，多次检测此批产品菌落总数均在5000左右，超过我司的内控标准。但客户检测数目与我司不符，于是我司把产品送到当地的技术监督局检测，所得结论是菌落总数为：205个/克。所以我们老总怀疑我们的工作能力，但问题是在其中一次操作中，我们同时化验两种不同品牌的鸡精，一种不符合要求，一种可以。 菌落总数的测定菌落总数的测定 菌落总数快速检测纸片菌落总数快速检测纸片 菌落总数的测定菌落总数的测定 电阻抗法测定细菌总数电阻抗法测定细菌总数原理

87、原理：供细菌生长的液体培养基是电的良导体，在特制的测量管底部装入电极插头，即可对接种生长的培养基的阻抗变化进行检测。阻抗变化的产生是由于微生物生长过程中的新陈代谢使培养基中的大分子营养物质(糖、脂类、蛋白质等）被分解成小分子代谢物，即较小的带电离子（乳酸盐、醋酸盐、重碳酸或氨等）这些代谢产物的出现和聚集，增强了培养基的导电性能，从而降低了其阻抗值: M=(RM=(R0 0-R-RT T)/R)/R0 0100%100% ，其中其中R R0 0表示开始时培养基的阻抗值，表示开始时培养基的阻抗值， R RT T表示任意时表示任意时刻培养基的阻抗值，刻培养基的阻抗值，M M表示培养基电阻减少的百分数

88、。表示培养基电阻减少的百分数。电阻越小细菌活动越多，在一定范围内，菌落形成单位（CFU）的对数Log(CFU)与IDT（阻抗检测时间）呈直线关系。菌落总数的测定菌落总数的测定 电阻抗法测定细菌总数电阻抗法测定细菌总数优缺点优缺点：常规经典检测方法结果准确可靠，但却存在繁琐、工作量大，好时过长；电阻抗法叫省力，样品细菌数在418小时内出结果。电阻抗法制作标准曲线过程中工作量较大，但以后的检测简便的多，不需要一系列稀释，只需样品1ml，培养基9ml，测量管一只。大肠菌群的测定大肠菌群的测定 基本概念基本概念大肠菌群指一群37、24h能发酵乳糖，产酸，产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌

89、主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。大肠菌群包括大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群的来源分粪便来源和非粪便来源，在44.5仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群，粪大肠菌群又叫耐热大肠菌群，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直接和贴切，主要就是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属，正是由于包括了克雷伯氏菌属，使其与粪便污染的相关性受到了影响。大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌这三个指标在实际工作中都在应用，但用途有所不同，一般认为大肠菌群是水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标

90、，粪大肠菌群主要用于贝类和贝类养殖用水的卫生指标，大肠杆菌用于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工。大肠菌群表示方法：MPN（ mostprobablenumber） /100mL 。 大肠菌群的测定大肠菌群的测定 乳糖发酵法（国标）乳糖发酵法（国标）检验稀释检验稀释取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同。乳糖发酵试验乳糖发酵试验根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。置361温箱内,培养242小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则

91、与对照的混合菌种一起按下列程序进行。分离培养分离培养将产气的发酵管分别在伊红美兰伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置361温箱内，培养1824小时后取出,观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。证实试验证实试验在上述平板上,挑取可疑大肠菌落12个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置361温箱培养242小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性.报告报告根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。结果结果粪大肠菌群的测定粪大肠菌群的测定检验稀释44乳糖发酵试验将接稀释液的乳糖胆盐发酵管，置于（440

92、.5）水浴中，经（242）h培养。证实试验：将所有产气发酵管，分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置（361）培养1824h，并同时接种蛋白胨水，置（440.5）培养24h。在平板上观察典型菌落，并做镜检。在蛋白胨水内加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。结果靛基质阳性，平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。大肠菌群的测定大肠菌群的测定 出口食品行业标准出口食品行业标准n检测方法n结果记录大肠菌群的测定大肠菌群的测定 注意事项注意事项初发酵阳性管，只能经过平板分离和证实实验后，才有可能成为阳性。一般地说，如果平板上有较多典型大肠菌群菌落，革兰氏染色为阳性杆菌，即可做出判定。如果平板上有典

93、型菌落甚少或不够典型，则应多挑菌落做证实试验，以免出现假阳性。只做一步初发酵，就作判定，会有相当部分的合格产品被作为不合格样品处理。在实际工作中，有时遇到初发酵时产酸，但导管内无气泡产生，复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时导管内无气体，但在液面及管壁却可看到小气泡。导管管口的完整情况与导管外有无沉渣存在均可影响产气反应的观察，管口不完整性有利于气体进入导管，管口周围有沉渣能阻碍或延缓气体进入。大肠菌群菌落的色泽形状与检出率密切相关，伊红美蓝平板上大肠菌群菌落呈黑紫色，有光泽或无光泽时，检出率最高。红色、粉红色菌落检出率较低。MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的毫升（克）系指原样品的毫升（克）数，

94、并非样品稀释后的毫升（克）数。在进行产品检测前，根据产品标准选择度，如大肠菌群标准30个/100毫升（克）时，应选择稀释度为11.1毫升（克）。大肠菌群标准3个/100毫升（克）时，稀释度则为1.11毫升（克）大肠菌群的测定大肠菌群的测定 注意事项注意事项如何避免放小倒管时产生气泡（大肠菌群检测）？ 客户要求大肠菌群ml(g),请问如何检测和报告？伊红美蓝是鉴别培养基，请问鉴别的原理是什么？ 大肠菌群的测定大肠菌群的测定 快速检测方法快速检测方法nLTSE快速检测法：n纸片快速法nTTC（氯化三苯四氮唑）显色快速法nDC（去氧胆酸钠）半固体试管快速法金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌的检测 概

95、概 述述葡萄球菌（Staphylococcus)是微球菌科的一个属，在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病的腐物寄生菌，也有一些致病的球菌。葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。其中金黄色葡萄球菌(staphyaureus)为致病菌、表皮葡萄球菌偶尔致病（staphyepidermidis)、腐生葡萄球菌（staphysaprophyticus)一般为非致病菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列，直径为0.51m，无芽孢、无鞭毛、无荚膜。在普通肉汤培养基上，形成圆

96、形、凸起、边缘整齐、表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。需氧或兼性厌氧；最适生长温度为3037；最适生长pH为67。耐盐性强，能在含715氯化钠的培养基中生长。对氯化汞、新霉素、多粘菌素具有很强的抗性，多数产肠毒素的肠毒素的菌株在血琼脂平板上能形成溶血圈，并能产生血浆凝固酶菌株在血琼脂平板上能形成溶血圈，并能产生血浆凝固酶，这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。金黄色葡萄球菌流行病学及致病性金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌的检测 测定方法测定方法国标方法国标方法注意事项现象观察：染色镜检（形态、染色）、Baird-Parker琼脂平板（BP平板）、血平板、血浆凝固酶试验出现的

97、问题金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌的检测 测定方法测定方法行业标准金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌的检测 测定方法测定方法出口食品中金黄色葡萄球菌检测方法溶血性链球菌检测溶血性链球菌检测 概述概述溶血性链球菌检测溶血性链球菌检测 测定方法测定方法国标注意事项：n血平板上如何区分金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌？金黄色葡萄球菌的菌落大些；金黄色葡萄球菌往往产生金黄色的色素；实在无法鉴别时，可进行革兰氏染色来鉴别。n污染较严重的样品，用匹克肉汤增菌培养，因含有三氮化钠能够抑制革兰氏阴性细菌的生长。沙门氏菌检测沙门氏菌检测 概述概述原理：沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，周生鞭毛（鸡

98、白痢和鸡伤寒沙门氏菌除外）。兼性厌氧，最适生长温度37。在普通显微镜下和在普通培养基中不能与大肠杆菌进行区分。但沙门氏菌不发酵乳糖，在肠道菌鉴别培养基上形成无色透明菌落，而易与大肠杆菌区别。沙门氏菌有着复杂的抗原构造，一般分为菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和毒力（Vi）抗原三种。沙门氏菌属包括2000个以上血清型，但多数国家从人体、动物和食品中经常分离到有4050种血清型。致病性中毒现象沙门氏菌检测沙门氏菌检测 检测方法检测方法GB前增菌，用无选择性的培养基使处以濒死状态的沙门氏菌恢复活力选择性增菌，使沙门氏菌得以繁殖，而大多数的其他细菌受到抑制选择性平板分离沙门氏菌生化试验，鉴定到属血清学分

99、类型鉴定。沙门氏菌检测沙门氏菌检测 注意事项注意事项结果记录现象观察：菌落特征、革兰氏染色、BS琼脂、HE琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂常见问题：志贺氏菌检测志贺氏菌检测 概述概述n志贺氏菌属（shigella）是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。大小为0.50.723m，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。多数有菌毛。革兰氏阴性杆菌。兼性厌氧菌，能在普通培养基上生长，形成中等大小，半透明的光滑型菌落。在肠道杆菌选择性培养基上形成无色菌落,与肠杆菌科各属细菌的主要区别为不运动。分解葡萄糖，产酸不产气。大多数不发酵乳糖。vp试验阴性，不分解尿素，不形成硫化氢，不能利用枸橼酸盐作

100、为碳源。宋内氏志贺氏菌能迟缓发酵乳糖（3734天）。n本属细菌对理化因素的抵抗力较其他肠道杆菌为弱。对酸敏感，在外界环境中的抵抗力能以宋内氏菌最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般5660经10分钟即被杀死。在37水中存活20天，在冰块中存活96天，蝇肠内可存活910天，对化学消毒剂敏感，1%石碳酸1530分钟死亡。n志贺氏菌抗原结构由菌体（O）抗原和表面（K）抗原组成。利用O抗原的复杂性可将志贺氏菌分成A、B、C、D四群，相当于痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌，每一群又可利用O抗原进行分型。引起食物中毒的主要是福氏志贺氏菌和宋内氏志贺菌。志贺氏菌检测志贺氏菌检测 检测方

101、法检测方法GB志贺氏菌检测志贺氏菌检测 注意事项注意事项现象观察：革兰氏染色，形态观察，HE琼脂，SS琼脂，麦康凯，TSI致泻大肠埃希氏菌检验致泻大肠埃希氏菌检验 概述概述n大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，为正常菌群存在于人和动物的肠道中，并广泛分布于自然界中。牛和猪的带菌是传播本菌引起食物中毒的重要原因。人的带菌者亦可以引起污染食品，引起食物中毒。n分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，引起腹泻的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（此名称不易与致病性大肠杆菌相混淆），一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附

102、性大肠杆菌（EAEC）。文献报道还有几种，如：凝集性大肠杆菌、即产VT毒素又具有侵袭性的大肠杆菌等，但目前尚未达成统一共识。产生的肠毒素有两种：不耐热的肠毒素（LT）和耐热的肠毒素（ST）n正常情况下，大肠埃希氏菌不致病，而且还能合成维生素B和维生素K，生产大肠菌素，对机体有利。但当机体抵抗力下降或大肠埃希氏侵入肠外组织或器官时，可引起条件性致病而引起肠道外感染。致泻大肠埃希氏菌检验致泻大肠埃希氏菌检验 检测方法检测方法GB致泻大肠埃希氏菌检验致泻大肠埃希氏菌检验 注意事项注意事项现象：麦康凯、形态、染色大肠埃希氏菌检验大肠埃希氏菌检验 快速检测方法快速检测方法n荧光法：紫外线、荧光抗体n大肠

103、杆菌在大肠杆菌大肠杆菌在大肠杆菌/大肠菌群显色培养基上典型特征大肠菌群显色培养基上典型特征大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色菌落。小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌是近几年来国内外很受重视的肠道菌。我国也有广泛的分布。本菌以肠道感染为主，食品和饮水受到本菌污染，乃是肠炎型耶尔森氏菌病爆发的重要原因。有些肠道菌在6以下不能繁殖，而本菌在04可以发育，因而对于这种可通过食物传播，而具有嗜冷性的致病菌必须予以重视。 本菌分布广，曾从乳、乳制品、肉、水产等食品，以及猪、牛、羊、狗、鼠及禽类的排泄物检出，猪的带菌率较高(417%)可见家畜，特别

104、是猪，是人类致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的贮存寄生。 小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌 检测方法检测方法nGBnSN空肠弯曲菌 n一、生物学性状一、生物学性状n（一）形态与染色（一）形态与染色n空肠弯曲菌（空肠弯曲菌（C.jejuni）菌体轻度弯曲似逗点状，长）菌体轻度弯曲似逗点状，长1.55m,宽宽0.20.8m。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。有荚膜，不形成芽胞。n（二）培养特性（二）培养特性n为微需氧菌，在含为微需氧菌，在含2.55%氧和氧和10%CO2的环境中生长最好。最适温度为的

105、环境中生长最好。最适温度为3742。在正常大气或无氧环境中均不能生长。本菌在普通培养基。在正常大气或无氧环境中均不能生长。本菌在普通培养基上难以生长，在凝固血清和血琼脂培养基上培养上难以生长，在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。n（三）生化反应（三）生化反应n空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素，靛基质阴性。可还原硝酸盐，氧化酶和过氧化氢酶为阳性。能产生微量或不产生硫化氢，空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素，靛基质阴性。

106、可还原硝酸盐，氧化酶和过氧化氢酶为阳性。能产生微量或不产生硫化氢，甲基红和甲基红和VP试验阴性，枸椽酸盐培养基中不生长。试验阴性，枸椽酸盐培养基中不生长。n（四）抵抗力（四）抵抗力n抵抗力不强，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，抵抗力不强，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，565分钟可被杀死。对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生分钟可被杀死。对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。近年发现了不少耐药菌株。素敏感。近年发现了不少耐药菌株。n（五）抗原构造（五）抗原构造n本菌抗原构造与肠道杆菌一样具有本菌抗原构造与肠道杆菌一样具有O、H和和K抗原

107、。根据抗原。根据O抗原，可把空肠弯曲菌分成抗原，可把空肠弯曲菌分成45个以上血清型，第个以上血清型，第11、12和和18血清型最为常见。血清型最为常见。n二、致病性与免疫性二、致病性与免疫性n空肠弯曲菌是多种动物如牛、羊、狗及禽类的正常寄居菌。在它们的生殖道或肠道有大量细菌，故可通过分娩或排泄物污染食物和饮水。空肠弯曲菌是多种动物如牛、羊、狗及禽类的正常寄居菌。在它们的生殖道或肠道有大量细菌，故可通过分娩或排泄物污染食物和饮水。n从群普遍易感，从群普遍易感，5岁以下儿童的发病率最高，夏秋季多见。苍蝇亦起重要的媒介作用。亦可经接触感染。感染的产妇可在分娩时传染给胎儿。岁以下儿童的发病率最高，夏秋

108、季多见。苍蝇亦起重要的媒介作用。亦可经接触感染。感染的产妇可在分娩时传染给胎儿。n本菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。潜伏期一般为本菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。潜伏期一般为35天，对人的致病部位是空肠、天，对人的致病部位是空肠、回肠及结肠。主要症状为腹泻和腹痛，有时发热，偶有呕吐和脱水。细菌有时可通过肠粘膜入血流引起败血症和其他脏器感染，如脑膜炎、关节炎、回肠及结肠。主要症状为腹泻和腹痛，有时发热，偶有呕吐和脱水。细菌有时可通过肠粘膜入血流引起败血症和其他脏器感染，如脑膜炎、关节炎、肾盂肾炎等

109、。孕妇感染本菌可导致流产，早产，而且可使新生儿受染。肾盂肾炎等。孕妇感染本菌可导致流产，早产，而且可使新生儿受染。n感染后能产生特异性血清抗体，可增强吞噬细胞功能。目前尚未测得肠道局部感染后能产生特异性血清抗体，可增强吞噬细胞功能。目前尚未测得肠道局部SlgA抗体。抗体。n三、微生物学诊断三、微生物学诊断n（一）分离培养（一）分离培养n取服用抗生素前的腹泻粪便或宫颈粘液等，取服用抗生素前的腹泻粪便或宫颈粘液等，3小时之内接种于具有高度选择性的平板培养（以布氏菌分离琼脂培养基为基础再加小时之内接种于具有高度选择性的平板培养（以布氏菌分离琼脂培养基为基础再加10%羊血，另外羊血，另外每升加入万古霉

110、素每升加入万古霉素10mg,多粘菌素多粘菌素B2500Iu，Amphoterin13mg,Cephalocin15mg），然后放玻璃缸内（内含），然后放玻璃缸内（内含85%N2，10%CO2，5%O2），置），置42孵箱内培养孵箱内培养48小时，挑选可疑菌落，再用生化反应和血清凝集试验作出最后鉴定。小时，挑选可疑菌落，再用生化反应和血清凝集试验作出最后鉴定。n（二）血清学检查（二）血清学检查n发病一周后，血清内可出现抗体，主要为发病一周后，血清内可出现抗体，主要为lgM，可用间接血凝试验及间接免疫荧光试验等检测特异性抗体效价，正常人或带菌者血清效价可达，可用间接血凝试验及间接免疫荧光试验等检测

111、特异性抗体效价，正常人或带菌者血清效价可达1：21：8，急性期病人抗体效价可达，急性期病人抗体效价可达1：81：32，恢复期可达，恢复期可达1：801：320以上。由于血清抗体效价不高，须采取双份血清检测，以效价增高以上。由于血清抗体效价不高，须采取双份血清检测，以效价增高4倍作为诊断依据。倍作为诊断依据。n四、防治原则四、防治原则n本病的预防在及时诊断和治疗病人，以免传播。加强卫生防疫及人畜粪便管理，注意饮食和饮水卫生。本菌对多种抗生素敏感，常用红霉素、本病的预防在及时诊断和治疗病人，以免传播。加强卫生防疫及人畜粪便管理，注意饮食和饮水卫生。本菌对多种抗生素敏感，常用红霉素、四环素治疗。四环

112、素治疗。空肠弯曲菌 检测方法检测方法nGB产气荚膜梭菌 检测方法检测方法nGB单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌 检测方法检测方法nGBnSN商业无菌商业无菌n无菌sterilization杀死食品中一切微生物（包括繁殖体、病原体、非病原体、部分芽孢）的过程。n超高温瞬时灭菌ultrahightemperatureshorttimesterilization采用高温、短时间，使液体食品中的有害微生物致死的灭菌方法。该法不仅能保持食品风味，还能将病原菌和具有耐热芽孢的形成菌等有害微生物杀死。灭菌温度一般为。灭菌时间一般为数秒。同义词：灭菌法。n商业无菌commercialsterili

113、zation罐头食品经过适度热杀菌后,不含有致病性微生物,也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物的状态。n消毒disinfection用物理或化学方法破坏、钝化或除去致病菌、有害微生物的操作。消毒不能完全杀死细菌芽孢。n巴氏消毒pasteurization采用较低温度（一般），在规定的时间内，对食品进行加热处理，达到杀死微生物营养体的目的。是一种既能达到消毒目的又不损害食品品质的方法。由法国微生物学家巴斯德发明而得名。同义词：巴氏灭菌。商业无菌商业无菌nGBn检验记录真菌学检验真菌学检验 概述概述n概述n介绍n由于遭到霉菌和酵母菌的侵染，食品和粮食常常发生霉坏变质，有些霉菌的有毒代谢

114、产物引起各种急性和慢性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性。实验证明，一次大量食入或长期少量食入，皆能诱发癌症。目前已知的产毒霉菌如青霉、曲霉和镰刀菌。真菌学检验真菌学检验 检测检测GB检验测试片真菌学检验真菌学检验 注意事项注意事项结果报告方式：cfu/g(ml)培养温度及时间稀释吹吸培养基的选用稀释平板的选择关键问题的探讨霉菌的直接计数法副溶血性弧菌副溶血性弧菌 概述概述中毒及预防主要特性：副溶性弧菌为革兰氏阴性、多形态、无芽孢杆菌、有嗜盐特性，在无盐的情况下不生长，在3037最适生长温度范围时，该菌生长繁殖较快；一般在冬季不易检出。在氯化钠血琼脂上，可见溶血环；氯化钠蔗糖琼脂上，菌落呈绿色。nGBnSN副溶血性弧菌副溶血性弧菌 检测检测副溶血性弧菌副溶血性弧菌 注意事项注意事项特征：染色、TCBS(SN)结果记录(SN)常见问题肉毒梭状芽孢杆菌肉毒梭状芽孢杆菌 概述概述性质中毒、诊断标准肉毒梭状芽孢杆菌肉毒梭状芽孢杆菌 检测检测GBSN肉毒梭状芽孢杆菌肉毒梭状芽孢杆菌 注意事项注意事项形态结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！148