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1、 1 1、概概概概述述述述：聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳（polyacrylamide polyacrylamide polyacrylamide polyacrylamide gel gel gel gel electropho electropho electropho electropho resis resis resis resis PAGEPAGEPAGEPAGE）是是是是以以以以聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶作作作作为为为为支支支支持持持持介介介介质质质质的的的的一一一一种种种种电电电电泳泳泳泳方方方方法法法法
2、。聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶具具具具有有有有机机机机械械械械强强强强度度度度好好好好，有有有有弹弹弹弹性性性性，透透透透明明明明，化化化化学学学学性性性性质质质质稳稳稳稳定定定定，对对对对pHpHpHpH和和和和温温温温度度度度变变变变化化化化小小小小，没没没没有有有有吸吸吸吸附附附附和和和和电电电电渗渗渗渗作作作作用用用用小小小小的的的的特特特特点点点点，是是是是一一一一种种种种很很很很好好好好的的的的电电电电泳泳泳泳支支支支持持持持介介介介质质质质。聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶是是是是由由由由丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺单单单单
3、体体体体（acry-lamideacry-lamideacry-lamideacry-lamide，简简简简称称称称AcrAcrAcrAcr） 和和和和 交交交交 联联联联 剂剂剂剂 N N N N， N-N-N-N-甲甲甲甲 叉叉叉叉 双双双双 丙丙丙丙 烯烯烯烯 酰酰酰酰 胺胺胺胺 （ methylane methylane methylane methylane bisacrylamidebisacrylamidebisacrylamidebisacrylamide，简称，简称，简称，简称BisBisBisBis）在）在）在）在催化剂催化剂催化剂催化剂作用下合成的。作用下合成的。作用下合
4、成的。作用下合成的。（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳1 1CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n
5、nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺2 2n nPAGEPAGE应应应应用用用用广广广广泛泛泛泛，可可可可用用用用于于于于蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质、酶酶酶酶、核核核核酸酸酸酸等等等等生生生生物物物物分分分分子子子子的的的的分分分分离离离离、定定定定性性性性、定定定定量量量量及及及及少少少少量量量量的的的的制制制制备备备备，还可测定分子量、等电点等还可测定分子量、等电点等还可测定分子量、等电点等还可测定分子量、等电点等 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围：聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围： 聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺
6、凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳按按按按原原原原理理理理和和和和操操操操作作作作形形形形式式式式的的的的不不不不同同同同，主主主主要要要要有有有有不不不不连连连连续续续续聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳，SDSSDS- -聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳，聚丙烯酰胺凝胶泳，聚丙烯酰胺凝胶泳，聚丙烯酰胺凝胶泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦等电聚焦等电聚焦等电聚焦电泳，电泳，电泳，电泳，双向电泳双向电泳双向电泳双向电泳等类型。等类型。等类型。等类型。3 3聚丙烯酰胺凝胶电泳条带聚丙烯酰胺凝胶电泳条带4 4二、聚丙烯酰胺凝胶的制备二
7、、聚丙烯酰胺凝胶的制备 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1.1.化学聚合化学聚合 化化学学聚聚合合的的催催化化剂剂通通常常采采用用过过硫硫酸酸铵铵（ammonium ammonium persulfatepersulfate，APAP），此此外外还还需需要要加加速速剂剂TEMEDTEMED（N N，N N，NN，N-N-四四甲甲基基乙乙二二胺胺），它它能能以以自自由由基基的的形形式式存存在在。微微量量TEMEDTEMED的加入，可使过硫酸铵形成的加入，可使过硫酸铵形成自由基自由基： S S2 2O O8 82-2- 2SO 2SO4 4- - 这这些些
8、自自由由基基的的产产生生可可引引发发丙丙烯烯酰酰胺胺与与甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。.5 5 2. 2. 光聚合光聚合光聚合光聚合 光光光光聚聚聚聚合合合合通通通通常常常常用用用用核核核核黄黄黄黄素素素素为为为为催催催催化化化化剂剂剂剂，核核核核黄黄黄黄素素素素经经经经光光光光照照照照形形形形成成成成无无无无色色色色基基基基，再再再再被被被被痕痕痕痕量量量量氧氧氧氧氧氧氧氧化化化化形形形形成成成成自自自自由由由由基基基基，引引引引发发发发聚聚聚聚合合合合反反反反应应应应。TEMEDTEMEDTE
9、MEDTEMED的存在，可以加速聚合。的存在，可以加速聚合。的存在，可以加速聚合。的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响：上述聚合反应受许多因素的影响：上述聚合反应受许多因素的影响：上述聚合反应受许多因素的影响： （1 1 1 1）大大大大气气气气氧氧氧氧能能能能淬淬淬淬灭灭灭灭自自自自由由由由基基基基，阻阻阻阻止止止止多多多多聚聚聚聚体体体体链链链链长长长长的的的的增增增增加加加加。在在在在进进进进行行行行化化化化学学学学聚聚聚聚合合合合前前前前，一一一一般般般般用用用用减减减减压压压压抽抽抽抽气气气气的的的的办办办办法法法法除除除除去去去去溶溶溶溶液液液液中中中中溶溶溶溶解解
10、解解的的的的空空空空气气气气。在在在在胶胶胶胶液液液液表表表表面面面面，往往往往往往往往覆覆覆覆盖盖盖盖一一一一层层层层水水水水或或或或溶溶溶溶液液液液，隔隔隔隔绝绝绝绝空空空空气气气气，可可可可加速聚合。加速聚合。加速聚合。加速聚合。 （2 2 2 2）低温低温低温低温、低、低、低、低pHpHpHpH都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。 （3 3 3 3）有有有有些些些些材材材材料料料料如如如如聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酸酸酸酸甲甲甲甲酯酯酯酯有有有有机机机机玻玻玻玻璃璃璃璃，一一一一些些些些金金金金属属属属等等等等可可可可抑抑抑抑制制制制聚
11、合反应。聚合反应。聚合反应。聚合反应。6 6 聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应：Ammonium persulfate (过硫酸胺, free radical initiator) Acrylamide (monomer)Bis(acrylamide) (bridge)TEMED (catalyst)生成 自由基聚合物 单体聚合物 桥联单体帮助传递自由基的催化剂SDS (Sodium dodecyl sulfate)Acrylamide 有毒性！油炸薯条中是否含有？-(O S-SO )442-2 SO4CH2=CH-CO-NH2121127 7 单体聚合反应：聚合反应交联物构成分枝端部自由基 可再延续
12、freeradicalBisBis聚合反应交错连接自由基形成8 8聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：聚丙烯酰胺凝胶有以下优点： n n几乎无电渗作用。几乎无电渗作用。几乎无电渗作用。几乎无电渗作用。n n化化化化学学学学性性性性能能能能稳稳稳稳定定定定，与与与与被被被被分分分分离离离离物物物物不不不不起起起起化化化化学学学学反反反反应应应应。对对对对pHpH和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。n n在在在在一一一一定定定定浓浓浓浓度度度度范范范范围围围围内内内内凝凝凝凝胶胶胶胶无无无无色色色色透透透透明明明明，有有有有弹弹弹弹性性性性，机机机机械性能好，易观察。械性
13、能好，易观察。械性能好，易观察。械性能好，易观察。n n凝胶孔径可调。凝胶孔径可调。凝胶孔径可调。凝胶孔径可调。n n分分分分辨辨辨辨率率率率高高高高，尤尤尤尤其其其其在在在在不不不不连连连连续续续续不不不不连连连连续续续续凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳中中中中，集集集集浓浓浓浓缩缩缩缩、分分分分子子子子筛筛筛筛和和和和电电电电荷荷荷荷效效效效应应应应为为为为一一一一体体体体，因因因因而而而而有有有有更更更更高高高高的分辨率。的分辨率。的分辨率。的分辨率。9 9 聚合反应注意事项： APS 很容易因受潮而失活1010 凝胶聚合的条件： 凝固时间与 APS 或 TEMED 量成反比 聚合程度
14、(%) 与温度成正比但与 APS 浓度无关1111 凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（取决于凝胶总浓度（取决于凝胶总浓度（取决于凝胶总浓度（T T T T）和）和）和）和AcrAcrAcrAcr与与与与BisBisBisBis两者之比。两者之比。两者之比。两者之比。凝胶总浓度凝胶总浓度凝胶总浓度凝胶总浓度（T T T T）和）和）和）和交联度交联度交联度交联度（C C C C）的计算公式分别为：的计算公式分别为：的计算公
15、式分别为：的计算公式分别为：T= C= T= C= T= C= T= C= 凝凝凝凝胶胶胶胶孔孔孔孔径径径径大大大大小小小小，主主主主要要要要受受受受凝凝凝凝胶胶胶胶浓浓浓浓度度度度的的的的影影影影响响响响。凝凝凝凝胶胶胶胶浓浓浓浓度度度度越越越越大大大大，孔孔孔孔径径径径越越越越小小小小。凝凝凝凝胶胶胶胶浓浓浓浓度度度度过过过过大大大大，胶胶胶胶硬硬硬硬而而而而脆脆脆脆，易易易易折折折折断断断断。浓浓浓浓度度度度过过过过小小小小，凝凝凝凝胶胶胶胶稀稀稀稀软软软软，不不不不易易易易操操操操作作作作，也也也也易易易易断断断断裂裂裂裂。当当当当凝凝凝凝胶胶胶胶浓浓浓浓度度度度确确确确定定定定后后后
16、后，交交交交联联联联度度度度为为为为5%5%5%5%时时时时，凝凝凝凝胶胶胶胶具具具具有有有有最最最最小小小小孔孔孔孔径径径径，超超超超过过过过5%5%5%5%或或或或低低低低于于于于5%5%5%5%时时时时凝凝凝凝胶胶胶胶孔孔孔孔径径径径都都都都要要要要增增增增大。大。大。大。 三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%12121313 在在在在浓浓浓浓度度度度为为为为7.5%7.5%7.5%7.5% 的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶中中中中，大大大大多多多多数数数数生生生生物
17、物物物体体体体内内内内的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质能能能能得得得得到到到到满满满满意意意意的的的的分分分分离离离离效效效效果果果果。因因因因此此此此，把把把把浓浓浓浓度度度度为为为为7.5%7.5%7.5%7.5% 凝凝凝凝胶胶胶胶称称称称为为为为标标标标准准准准胶胶胶胶。对对对对于于于于一一一一个个个个未未未未知知知知样样样样品品品品，常常常常用用用用7.5%7.5%7.5%7.5%的的的的标标标标准准准准胶胶胶胶或或或或4%-10%4%-10%4%-10%4%-10% 的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶梯梯梯梯度度度度来来来来测测测测试试试试，而而而而后后后后选选选选出出出出适适适适宜宜宜宜的凝
18、胶浓度。的凝胶浓度。的凝胶浓度。的凝胶浓度。 1414聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的组成：n n聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，可可分分为为连续连续的和的和不连续不连续的两类的两类 。n n前前者者指指整整个个电电泳泳系系统统中中所所用用缓缓冲冲液液，pHpH值值和和凝凝胶胶网网孔孔都都是是相相同同的的；后后者者是是指指在在电电泳泳系系统统中中采采用用了了两两种种或或两两种种以以上上的的缓缓冲冲液液、pHpH值值和和孔孔径径，不不连连续续电电泳泳能能使使稀稀的的样样品品在在电电泳泳过过程程中中浓浓缩缩成成层层，从从而而提高分辨能力。提高分辨能力。 1515
19、聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的組成：1电泳系统pH凝胶浓度缓冲液上层 (负极) 缓冲液 2样品溶液 3浓缩胶 6.9 4分离胶凝 胶 5下层 (正极) 缓冲液 Tris-HClTris-HClTris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.3 8.3 5% 7.520% - - - 凝胶不连续性具有浓缩样品的的作用1616垂直柱状电泳槽：LowerchamberUpperchamber+-+CoolingWaterRunningGelStackingGel电泳开始100150 V1717n n在不连续在不连续在不连续在不连续PAGEPAGEPAGEP
20、AGE系统里，存在三种物理效应，即系统里，存在三种物理效应，即系统里，存在三种物理效应，即系统里，存在三种物理效应，即电电电电荷效应荷效应荷效应荷效应、分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应和和和和浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应。n n电荷效应：各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，电荷效应：各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定速度泳动。在电场向一定电极，以一定速度泳动。n n分子筛效应：区别不同大小分子种类的能力是凝胶分子筛效应：区别不同大小分子种类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小的能力即分子筛效应。这种所具有的一种筛分大小的能力即分子筛效应。这种效应与凝胶过滤过程
21、中的情况不同。效应与凝胶过滤过程中的情况不同。 1818 浓缩效应：浓缩效应：1919 在浓缩胶中的三个主要影响因素：Glycine: Negative charged No net charge Chloride ion:Proteins:小分子大分子2020 浓缩胶对蛋白质分子的浓缩作用：分分离离胶胶浓浓缩缩胶胶样样品品8.96.9离子缺乏空间ABC+8.32121SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE) 2222 SDS 在蛋白质表面 均勻带上 一层负电：SDSboiling变性后的蛋白质成一线形分子天然蛋白质並且均勻帶上一层负电荷非极性尾部极性头部2323 三
22、种不同性质蛋白质的电泳比较：Molecular WeightpINative PAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternary StructureX YZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastX YZ-+2424XYZ+ SDSNative-PAGESDS-PAGE分子量分子量 及及 净电荷数量净电荷数量均可影响泳动率均可影响泳动率只有只有 分子量分子量 影响泳动率影响泳动率XYZ-+-25252626 天然蛋白分子量测定： Disc-PAGEk
23、D669440232140kD900800700600500400300200100Migration (cm)1 2 3 4 SS 不能以 disc-PAGE 为唯一点实验依据Mol mass2727 蛋白质单体分子量的測定： SDS-PAGE0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration (Rf)Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis2828 凝胶过滤层析的洗脱图谱：XYZEEnzymeactivity Elu
24、tion Volume (mL)AVoVeVt02929 凝胶内蛋白质的洗脱：直接挖出凝胶进行洗脱Little Blue TankISCO: Little Blue Tank Concentrator3030Bio-Rad电洗脱槽电洗脱槽Bio-Rad电泳仪电泳仪3131水平板式电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽Bio-Rad垂直板式电泳槽系统垂直板式电泳槽系统3232电泳相关技术电泳相关技术3333凝胶扫描仪凝胶扫描仪凝胶真空干燥仪凝胶真空干燥仪凝胶成像仪凝胶成像仪1. 1. 凝胶干燥和扫描技术凝胶干燥和扫描技术3434Bio-Rad 凝胶成像系统凝胶成像系统2. 凝胶成像技术
25、凝胶成像技术353536363737电泳印迹n n电泳转移即电泳印迹。它是利用低电压，大电流的直流电场使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上 。3838核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交技术是在1968年由Britten及其同事发明的，是指非同一分子来源但具有互补序列（或某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过Watson-Crick碱基配对形成稳定的双链分子的过程，若其中的一条链被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检测出，即成为所谓的探针。探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了同样标记，可被检测出来。这样，以特定的已知核苷酸序列做探针，就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂交探测出与其互补的序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定，检测外源基因整合和表达的强有力的手段。它具有灵敏性高（可检测出10-12g,即1pg DNA样品）、特异性强的特点。蛋白质分子杂交蛋白质分子杂交是利用抗原与抗体特异结合的原理检测外源基因表达情况的方法。分子杂交可以在液相中或固相中进行。目前实验室中广泛采用的是固相膜上进行的固-液杂交。3939404041414242434344444545464647474848
