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1、实验三实验三 细菌的分离培养及移植细菌的分离培养及移植 两个概念两个概念： 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。本技术之一。 分离：分离：从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法；方法； 纯培养：纯培养：一株菌种或一个培养物中所有的细菌一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。实验目的：实验目的：1 1 掌握细菌分离培养的基本要领和方法掌握细菌分离培养的基本要领和方法2 2 掌握挑菌、纯培养及移植技术掌握挑菌、纯培养及移植技术3 3 了解细菌
2、的菌落形态及其在各种培养基上的培养了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状性状实验材料：实验材料：球球1 1 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的混合培养肉汤等；菌的混合培养肉汤等；2 2 培养基：普通肉汤、普通琼脂斜面、普通琼脂平培养基：普通肉汤、普通琼脂斜面、普通琼脂平板板3 3 器械：剪刀、记号笔、酒精灯、接种环器械：剪刀、记号笔、酒精灯、接种环一一 需氧型细菌分离培养法需氧型细菌分离培养法1. 1. 平板划线分离法平板划线分离法 菌种菌种被其他被其他杂菌污染杂菌污染时或时或混合菌悬液混合菌悬液常用平板划线法进行纯常用平板划线法进
3、行纯种分离。种分离。 此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连多方向连续划线续划线，使混杂的微生物细胞在，使混杂的微生物细胞在平板表面分散平板表面分散，以求得到分散，以求得到分散的由的由单个微生物细胞繁殖单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。而成的菌落，从而达到纯化目的。划线培养时注意问题：划线培养时注意问题：(1)左手持皿，用左手拇指、食指及中指将平皿左手持皿，用左手拇指、食指及中指将平皿揭揭开约呈开约呈20的角度的角度(图图1)；(2)右手持接种环，右手持接种环，灼烧冷却灼烧冷却后从混合培养肉汤中后从混合培养肉汤中取取少量涂
4、布少量涂布于培养基边缘，开始划线于培养基边缘，开始划线(图图2)；(3)划线前先将划线前先将接种环稍稍弯曲接种环稍稍弯曲，使之易，使之易与琼脂面与琼脂面平行，不致划破培养基；平行，不致划破培养基；(4)划线中划线中不易不易过多的过多的重复旧线重复旧线，以免形成菌苔；，以免形成菌苔；(5)接种完毕，在皿底接种完毕，在皿底作好标记作好标记（菌名、日期、接（菌名、日期、接种者等），种者等），平皿倒扣平皿倒扣，置于，置于37培养。培养。图图2 2 连续划线法连续划线法 区划线法区划线法图图1 划线分离示意图划线分离示意图2.2.纯培养的获得与移植法纯培养的获得与移植法 -琼脂斜面分离法琼脂斜面分离法将
5、将37下培养下培养24h的平板从温箱取出，挑取的平板从温箱取出，挑取单个菌落，镜检单个菌落，镜检不含杂菌不含杂菌，即用接种环，即用接种环挑取挑取单个菌落单个菌落移植于琼脂斜面培养，所得的培养移植于琼脂斜面培养，所得的培养物即为物即为纯培养物。纯培养物。图图3 3 斜面接种时试管的拿法斜面接种时试管的拿法图图4 4 斜面接种时无菌操作的程序斜面接种时无菌操作的程序 左手左手斜持菌种管斜持菌种管和和被接种琼脂斜面管被接种琼脂斜面管，使管，使管口相互并齐，管底部放在拇指和食指之间，口相互并齐，管底部放在拇指和食指之间，松松动两管塞子动两管塞子，以便接种时易拔出（图，以便接种时易拔出（图3）。）。 右
6、手持接种棒，右手持接种棒，火焰灭菌火焰灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管塞，将管口进行火后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰。焰灭菌，使其靠近火焰。 将接种环将接种环深入菌种管内深入菌种管内，先在无菌生长的，先在无菌生长的琼脂上接触琼脂上接触使之使之冷却冷却，再，再挑取少许细菌挑取少许细菌后拉出接后拉出接种环立即种环立即放入另一斜面培养基放入另一斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。 从从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，灭菌接种，管
7、口通过火焰灭菌，塞好棉塞，灭菌接种环，作好标记，置于环，作好标记，置于3737温箱培养。（图温箱培养。（图4 4）2.1 2.1 两试管间的斜面移植两试管间的斜面移植2.2 2.2 平板到试管斜面移植平板到试管斜面移植 手执接种棒，火焰灭菌，手执接种棒，火焰灭菌，左手打开平皿盖左手打开平皿盖，将接种，将接种环置于平皿盖上使之冷却；环置于平皿盖上使之冷却； 挑取可疑的菌落挑取可疑的菌落，左手盖上平皿盖后立即取斜面管，左手盖上平皿盖后立即取斜面管，深入斜面管中，从深入斜面管中，从斜面底部开始划曲线，向上至斜面斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止顶端为止； 管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，灭菌接种环，
8、作好管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，灭菌接种环，作好标记，置于标记，置于3737温箱培养。温箱培养。 当组织当组织病料中含病原菌少病料中含病原菌少，或有，或有抗菌药残留抗菌药残留时，用琼时，用琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，为脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，为提高提高由病料中由病料中分离培养细菌的机会分离培养细菌的机会，这时可以无菌操作剪取一小块病，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入料直接投入肉汤肉汤，经，经3737培养培养，在肉汤中长出细菌后，在肉汤中长出细菌后，观察其在液体培养基上的生长表现，再用琼脂斜面或琼观察其在液体培养基上的生长表现，再用琼脂斜面或琼脂平板分离。脂平板分离。3.
9、3.营养肉汤增菌培养法营养肉汤增菌培养法 4.4.穿刺培养法穿刺培养法 半固体移植半固体移植多用穿刺法接种。多用穿刺法接种。 方法基本与纯培养接种相同，不同的是用接方法基本与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，种针挑取菌落，垂直刺入培养基垂直刺入培养基内。从培养基内。从培养基表面的表面的中部一直刺入管底中部一直刺入管底，然后按，然后按原方向退出原方向退出即可。即可。5.5.倾注培养法倾注培养法 取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，加热融化，冷至约取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，加热融化，冷至约5050用火焰灭菌用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充分摇匀后，自第一管取一接种环
10、内容物接种环钓取待分离物接种至第一管内，充分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于凝固后倒转置于3737温箱内培养温箱内培养24h24h。结果。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则，通常第一个平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。逐渐减少，可见单个菌落。6.6.芽胞需氧菌分离培养法芽胞需氧菌分离培养法
11、 如果被检材料中如果被检材料中可疑有带芽孢可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于置于8080水浴箱中维持水浴箱中维持15152020分钟分钟，再进行培养。材料中若有，再进行培养。材料中若有带芽孢带芽孢的细菌仍可的细菌仍可存活而生长繁殖存活而生长繁殖，不耐热的不耐热的细菌繁殖体则细菌繁殖体则被杀灭被杀灭。7.7.利用化学药品的分离培养法利用化学药品的分离培养法 (1)(1)抑菌作用抑菌作用: : 有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制作用，所以可利用这种
12、特性进行细菌的分离。抑制作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离。(2)(2)杀菌作用杀菌作用: : 将病料如结核病料用将病料如结核病料用1515硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核杆菌因具有抗酸性而存活。结核杆菌因具有抗酸性而存活。(3)(3)鉴别作用鉴别作用: : 利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。别某种细菌。8.8.通过实验动物分离法通过实验动物分离法 被检病料中疑有某种病原菌存在，将病料无菌取出，无菌研磨后加被检病料中疑有某种病原菌存在，将病料无菌取出，无菌研磨后
13、加3 35 5倍量无倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物，待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。易感实验动物，待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。二二 厌氧型细菌分离培养法厌氧型细菌分离培养法 细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌厌氧菌，则需将培养环境或培养基中的，则需将培养环境或培养基中的氧气除去氧气除去，或将氧化型物质还原，或将氧化型物
14、质还原，降低其氧化还原电势降低其氧化还原电势，才能，才能生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。分压是十分必要的。 现有的厌氧培养法很多，主要有现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学生物学法、化学法和物理学法法，可根据各实验室的具体情况而选用。，可根据各实验室的具体情况而选用。(1) (1) 动物组织及其他物质加入法：在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动动物组织及其他物质加入法：在液体培养基内
15、加入肝脏、肾脏等动物脏器，因其中的半胱氨酸的一物脏器，因其中的半胱氨酸的一SHSH基极不稳定，为强还原剂。基极不稳定，为强还原剂。(2) (2) 共栖培养法：将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需共栖培养法：将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。1. 1. 生物学法生物学法2. 2. 化学方法化学方法 利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还原氧化型物质，降低氧化原氧化型物质，降低氧化- -还
16、原电势。还原电势。(1)(1)焦性没食子酸法焦性没食子酸法: : 平板培养法、平板培养法、BuchnerBuchner氏试管法、史氏厌氧培养氏试管法、史氏厌氧培养法、平皿厌氧培养法法、平皿厌氧培养法 、玻罐或干燥器法、玻罐或干燥器法(2)(2)李伏夫（李伏夫（B.M.JIbBOBB.M.JIbBOB）氏法）氏法 (3)(3)硫乙醇酸钠法：液体培养基法、固体培养基法硫乙醇酸钠法：液体培养基法、固体培养基法 3. 3. 物理学方法物理学方法 厌氧罐法、真空干燥器法、加热密封法、高层琼脂柱厌氧罐法、真空干燥器法、加热密封法、高层琼脂柱三三 细菌培养性状的检查细菌培养性状的检查（一）细菌在固体培养基上
17、的生长表现（一）细菌在固体培养基上的生长表现1.1.琼脂平皿上的生长表现琼脂平皿上的生长表现 ：细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼可见的细菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可可见的细菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鉴别某种细菌。以在一定程度上鉴别某种细菌。 葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落的菌落；炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整齐的火焰状菌落，用放大镜观；炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整
18、齐的火焰状菌落，用放大镜观察时，呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、察时，呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、大小不等的菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。观察菌大小不等的菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。观察菌落的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。落的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。( (见图见图5-6)5-6)图图5 5 菌落的形态菌落的形态从左到右，从上到下分别是：从左到右，从上到下分别是：1.1.圆形、边缘整齐、表面光滑；圆形、边缘整齐、表面光滑；2 2圆形、
19、边圆形、边缘整齐、表面有同心圆；缘整齐、表面有同心圆；3 3圆形、叶状边缘、表面有放射状皱褶；圆形、叶状边缘、表面有放射状皱褶；4 4圆形、圆形、锯齿状边缘、表面较不光滑；锯齿状边缘、表面较不光滑；5 5不规则形、波浪状边缘、表面有不规则皱不规则形、波浪状边缘、表面有不规则皱纹；纹；6 6圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状；圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状；7 7毛状毛状 ；8 8根状根状图图6 6 菌落的隆起度菌落的隆起度左到右，上到下：左到右，上到下：1 1扁平状；扁平状； 2 2低隆起；低隆起；3 3隆起；隆起；4 4台台状；状； 5 5脐状；脐状；6 6纽扣状；纽扣状；7 7乳头状；乳头
20、状；8 8褶皱凸面褶皱凸面2.2.琼脂斜面上生长表现琼脂斜面上生长表现 将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上（自底部将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上（自底部向上划一直线），培养后观察其生长表现。向上划一直线），培养后观察其生长表现。( (见图见图7 )7 )3 3琼脂柱穿刺培养中的生长表现琼脂柱穿刺培养中的生长表现 将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，培养后观察其生长表现。培养后观察其生长表现。( (见图见图8)8)图图7 7 琼脂斜面培养的菌落表现琼脂斜面培养的菌落表现图图8 8 琼脂柱穿刺培养的菌落表现琼脂柱穿刺培养的菌落表现
21、1.1.线状；线状；2 2棘状；棘状；3 3珠状；珠状；4 4绒毛状；绒毛状；5 5根状根状（二）细菌在明胶柱穿刺培养中的生长表现（二）细菌在明胶柱穿刺培养中的生长表现 取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱，取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱， 置置22温箱温箱中培养后观察其液化情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相同中培养后观察其液化情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相同(见图见图9)。（三）细菌在液体培养基中的生长表现（三）细菌在液体培养基中的生长表现 将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤将马腺疫链球菌、绿脓
22、杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培养后观察其生长情况中，培养后观察其生长情况(见图见图10)。 图图9 细菌明胶柱穿刺培养生长表现细菌明胶柱穿刺培养生长表现1. 不液化；不液化；2火山口状；火山口状；3.芜箐状；芜箐状；4.漏斗状；漏斗状；5.囊状；囊状；6.层状层状图图10 细菌在肉汤中生长表现细菌在肉汤中生长表现1絮状；絮状；2环状；环状；3厚膜状；厚膜状；4均匀状均匀状思考题思考题1、细菌分离培养的目的，什么是纯培养？细菌分离培养的目的，什么是纯培养？2、常用细菌分离培养的方法有哪些？、常用细菌分离培养的方法有哪些？3、划线分离培养以及普通琼脂培养应注意的问题是什么、划线分离培养以及普通琼脂培养应注意的问题是什么？实验报告要求实验报告要求1、目的（前言）、目的（前言）2、材料与方法（实验方法）、材料与方法（实验方法）3、结果观察、结果观察
